山羊毛囊細胞分離培養(yǎng)與鑒定及毛囊體外重塑研究.pdf

1、以濟寧青山羊為動物模型，從毛囊細胞體外分離培養(yǎng)和體外毛囊重建研究角度闡明毛囊的生長發(fā)育規(guī)律、影響因素及毛囊真皮與表皮細胞的互作機制，不僅可為提高山羊毛絨產(chǎn)量和品質(zhì)的育種改良奠定基礎(chǔ);還可為加速提高毛絨品質(zhì)、數(shù)量和揭示毛發(fā)再生機理乃至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的人類毛發(fā)研究等提供借鑒。毛囊細胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)的完善，體外重塑毛囊模型的建立，可為研究毛囊生長與分化機制，相關(guān)細胞因子對皮膚毛囊細胞損傷修復(fù)的作用機理，尤其是哺乳動物毛纖維形成機制提供良好模型，也

2、是研究相關(guān)細胞因子以及激素對毛囊發(fā)育、羊毛品質(zhì)和黑色素形成與調(diào)控機理的基礎(chǔ)。本研究在成功構(gòu)建了多種山羊皮膚毛囊細胞體外分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)平臺的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了適宜的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)體系，成功構(gòu)建了毛囊體外重塑模型與毛纖維體外生成體系，可為進一步深入研究毛囊分化與發(fā)育的影響因素及其所涉及到的一系列生理現(xiàn)象，如皮膚毛囊細胞分化、真皮和表皮細胞間的互作、皮膚毛囊損傷和被清理機制等研究奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容、方法和結(jié)果如下:
　　 一、山羊毛

3、囊外根鞘細胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化
　　 無菌分離活體青山羊羔羊的次級毛囊，采用機械分離與酶消化相結(jié)合的方法，分離純一的毛囊外根鞘細胞(ORSC)，培養(yǎng)于含有表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和氫化可的松(hydrocortisone)的無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液中，置5％CO2濃度的37℃培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)。待原代細胞長成良好的單層后即可進行傳代培養(yǎng)，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)至8～10代時，更換含EGF、IGF-Ⅰ、氫化

4、可的松和2％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液進行長期培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液后可見細胞生長狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。選取穩(wěn)定傳代的ORSC進行生物學(xué)特性研究與鑒定。結(jié)果表明:該細胞的群體倍增時間為51.9h;培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，細胞免疫化學(xué)鑒定結(jié)果表明，外根鞘細胞角蛋白19表達呈陽性，證實本實驗分離培養(yǎng)的細胞確為由毛囊干細胞分化來的外根鞘細胞。
　　 二、山羊毛乳頭細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　 將中性蛋白酶與膠原酶消化及預(yù)

5、鋪設(shè)促貼壁培養(yǎng)基質(zhì)相結(jié)合，分離并純化山羊DPC，培養(yǎng)于含有表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。待原代細胞長至完全匯合并進行傳代培養(yǎng)后，更換含EGF、bFGF和2％FBS的MEM與DMEM/F12(1∶1)復(fù)合培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)，更換培養(yǎng)液后可見細胞生長狀態(tài)逐漸趨于穩(wěn)定。選取穩(wěn)定傳至第7代的DPC進行生物學(xué)特性研究與鑒定。結(jié)果表明:該細胞

6、的平均克隆形成率為60％，細胞增殖活力旺盛;培養(yǎng)細胞的染色體數(shù)仍以2n=60為主，細胞免疫熒光鑒定結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的DPCα-SMA和Vimentin表達均呈陽性，充分證實本實驗分離培養(yǎng)的細胞確為毛囊真皮源性的毛乳頭細胞。
　　 三、山羊真皮成纖維細胞的體外培養(yǎng)及其細胞系的建立
　　 利用中性蛋白酶(dispase)4℃冷消化法分離皮膚的表皮層和真皮層，以利于純化培養(yǎng)真皮成纖維細胞。然后，采用原代外植與酶消化相結(jié)合的方

7、法，分離純化的DFB:即先利用Dispase酶分離皮膚表、真皮層后，剪切真皮部分成組織小塊，再對小組織塊進行酶（胰蛋白酶）消化處理，隨即將真皮外植塊接種于6孔培養(yǎng)板底壁上。待貼牢后添加含有堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(tylosin)和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置5％CO2濃度的37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)板中的真皮

8、外植塊遷移出大量細胞時（約5～6天），換為含有bFGF、青霉素、鏈霉素、泰樂菌素(tylosin)和5％FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)進行培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液。待原代真皮成纖維細胞生長至匯合時，進行傳代，并于第一次傳代時更換為25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以利于真皮成纖維細胞在體外長期傳代培養(yǎng)與凍存。本研究所建立的DFB細胞系已經(jīng)穩(wěn)定傳至56代以上，其生長分裂狀態(tài)良好，細胞遺傳性狀穩(wěn)定。
　　 四、山羊體外重塑毛囊模型的建立和維持<

9、br>　　 在無菌冰浴條件下，將鼠尾膠原、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素A按比例依次混合到MEM與DMEM/F12(1∶1)復(fù)合培養(yǎng)液中，制成凝膠。調(diào)節(jié)pH后加入24孔板中。收獲前期分離培養(yǎng)與鑒定的純化毛乳頭、真皮成纖維細胞，用含EGF、bFGF和5％FBS的MEM與DMEM/F12(1∶1)混合培養(yǎng)液制成細胞混懸液，用無菌吸管將細胞混懸液加入24孔板中，待其在常溫下形成真皮細胞膠原凝膠后，置于37℃、5％CO2的飽和濕度環(huán)境中進行培養(yǎng)。每天在

10、顯微鏡下觀察DPC與DFB的生長增殖情況。待毛囊真皮細胞達到完全匯合后，表面覆蓋預(yù)先制備的ORSC細胞混懸液，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，觀察ORSC于毛囊真皮細胞膠原凝膠上形成完整單層后，去除舊的培養(yǎng)液，加入少量（恰好覆蓋表面ORSC細胞即可）含IGF-Ⅰ、EGF的無血清角質(zhì)細胞培養(yǎng)液，在37℃、5％CO2的飽和濕度環(huán)境中進行氣-液界面培養(yǎng)，每兩天更換一次表層培養(yǎng)基。經(jīng)顯微觀察拍攝、測微尺測量與實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，在進行氣液界面培

11、養(yǎng)初期，毛乳頭細胞即呈現(xiàn)凝集性生長趨勢，而表面的毛囊外根鞘細胞亦呈集落樣散在分布于真皮成纖維細胞層中。隨著氣液界面培養(yǎng)的進行，毛乳頭細胞進一步凝集性生長，部分外根鞘細胞集落通過凝膠中的真皮成纖維細胞單層遷移聚集在毛乳頭細胞團周圍，并不斷包繞，分化形成圓球樣的類毛球結(jié)構(gòu)貼附在真皮成纖維細胞層上。約經(jīng)過10天的體外培養(yǎng)，由幾種毛囊細胞形成的圓球狀結(jié)構(gòu)逐漸向外圍拉伸擴張，內(nèi)部的毛乳頭細胞向一端遷移生長，最終由毛球樣結(jié)構(gòu)伸展延長成類毛囊結(jié)構(gòu)，并

12、有毛纖維從基部長出，部分生長出的毛纖維顏色為濃黑色，內(nèi)含黑色素。各檢測數(shù)據(jù)顯示，體外重建的毛囊結(jié)構(gòu)與體內(nèi)正常毛囊比較無論在組織結(jié)構(gòu)、毛纖維生長速度，還是毛囊發(fā)育關(guān)鍵基因的表達調(diào)控方面，均差異不顯著。
　　 本研究優(yōu)化并建立了山羊毛囊細胞體外培養(yǎng)條件和體系，研究了細胞因子對毛囊真皮表皮細胞的影響，成功建立了山羊毛囊體外誘導(dǎo)重建體系，為揭示山羊毛囊分化發(fā)育與羊毛生長的影響因素和調(diào)控機理奠定了基礎(chǔ)和提供了模型;并為醫(yī)學(xué)研究和發(fā)現(xiàn)毛發(fā)疾