人胎兒毛囊隆突細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化.pdf

1、研究背景:目前在燒傷的臨床治療中所廣泛采用的自體斷層皮片移植法雖然成功救治了眾多患者，但也面臨著自體皮源不足、增加創(chuàng)面面積、移植后皮膚攣縮及缺乏皮膚附件等難題。組織工程技術(shù)的發(fā)展為燒傷創(chuàng)面的修復(fù)提供新的思路。目前已經(jīng)有商品化的組織工程皮膚應(yīng)用于臨床并取得一定的效果，但距理想的組織工程皮膚仍存在較大的差距，主要表現(xiàn)在缺乏毛囊，皮脂腺和汗腺等皮膚附屬器、免疫排斥、抗感染能力弱、支架來源有限及價(jià)格昂貴等。成體干細(xì)胞和生物材料領(lǐng)域的發(fā)展為解決上

2、述問題提供新的契機(jī)。組織工程成功與否取決于以下三個(gè)關(guān)鍵性制約因素：種子細(xì)胞、支架材料以及有助于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的外在環(huán)境。其中種子細(xì)胞一直是組織工程研究的核心問題。理想的種子細(xì)胞應(yīng)該具有容易獲得、容易在體外培養(yǎng)增殖、長(zhǎng)期傳代不改變生物學(xué)特性、抗原性小、組織修復(fù)能力強(qiáng)等特征。近年來研究表明表皮干細(xì)胞作為組織特異性干細(xì)胞，具有無限增殖和多項(xiàng)分化潛能，理論上可以分化為皮膚的各種細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，是包括附屬器在內(nèi)的皮膚的發(fā)生、修復(fù)、改建的關(guān)鍵性源泉

3、。目前認(rèn)為表皮干細(xì)胞儲(chǔ)存于皮膚基底膜和與之解剖相連的毛囊外根鞘隆突部位。而皮膚基底膜細(xì)胞中只含有4-10％的表皮干細(xì)胞，95％的表皮干細(xì)胞儲(chǔ)存于毛囊的隆突部。因而從毛囊隆突中分離干細(xì)胞具有容易獲得，組織需要量少的優(yōu)點(diǎn)。 研究目的:本課題的研究目的是快速、高效的體外分離、培養(yǎng)、純化毛囊隆突細(xì)胞，觀察其體外生物學(xué)特性及分化潛能，并接種于適合的真皮支架，體外構(gòu)建組織工程復(fù)合皮，在體觀察其參與功能性修復(fù)皮膚缺損創(chuàng)面的可行性。 研

4、究?jī)?nèi)容: 1.毛囊隆突細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法的改進(jìn)。分別用傳統(tǒng)的機(jī)械解剖分離法和改進(jìn)的膠原酶消化法分離毛囊隆突，比較兩者的分離效率；利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基和改進(jìn)培養(yǎng)基原代和傳代培養(yǎng)隆突細(xì)胞，比較在不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；利用胰蛋白酶和Ⅳ型膠原快速粘附對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成率、細(xì)胞周期、K19、K15免疫組化染色鑒定細(xì)胞的干細(xì)胞特性。 2.毛乳頭細(xì)胞對(duì)隆突細(xì)胞體外誘導(dǎo)。二步消化法分離培養(yǎng)人胎兒毛乳頭細(xì)胞，觀察毛乳頭細(xì)

5、胞的生長(zhǎng)特性，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組化染色鑒定，并將毛囊隆突細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞體外共培養(yǎng)，觀察毛乳頭細(xì)胞對(duì)隆突細(xì)胞體外誘導(dǎo)作用。 3.毛囊隆突細(xì)胞向皮脂腺細(xì)胞誘導(dǎo)分化。以3-甲基-1-異丁基黃嘌呤+胰島素+地塞米松作為誘導(dǎo)刺激因子，對(duì)第二代體外培養(yǎng)毛囊隆突細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察總結(jié)誘導(dǎo)后人毛囊隆突細(xì)胞形態(tài)變化和生物學(xué)特點(diǎn)，油紅染色鑒定細(xì)胞成脂情況，抗上皮膜抗原免疫組化染色鑒定細(xì)胞特征性變化。 4.人胎兒毛乳頭細(xì)胞和聚羥基

6、丁酯真皮支架細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)。利用浸泡聚羥基丁酯24小時(shí)的浸提液培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基分別對(duì)毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)在不同培養(yǎng)基作用下細(xì)胞增殖變化；將毛乳頭細(xì)胞接種于聚羥基丁酯支架上，MTT法檢測(cè)在不同時(shí)間細(xì)胞增殖曲線；在連續(xù)培養(yǎng)一周后進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞與支架粘附情況。 5.人胎兒毛乳頭細(xì)胞在聚羥基乙酸真皮支架上的生長(zhǎng)特性觀察。利用浸泡聚羥基乙酸支架材料24小時(shí)的浸提液培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基分別對(duì)毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，MT

7、T法檢測(cè)在不同培養(yǎng)基作用下細(xì)胞增殖變化；將材料切成2mmx2mm小塊，浸沒于牛I型膠原中濕化、凍干，進(jìn)行膠原包被；將毛乳頭細(xì)胞分別接種于聚羥基乙酸、膠原包被聚羥基乙酸三維支架和空白培養(yǎng)板中，在不同時(shí)間消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)，比較不同組細(xì)胞增殖曲線；在連續(xù)培養(yǎng)一周后進(jìn)行病理切片HE染色和掃描電鏡觀察細(xì)胞與支架粘附情況；將聚羥基丁酯、聚羥基乙酸和異種脫細(xì)胞真皮三種支架材料修剪成25mm×5mm大小，萬能材料分析機(jī)檢測(cè)不同材料的生物力學(xué)特性，包括最大

8、拉伸力、最大負(fù)荷、抗拉強(qiáng)度等，并描記拉伸曲線。 6.人胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)。Dispase酶分離表皮和真皮；胰酶消化法獲得表皮細(xì)胞懸液；用含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代角質(zhì)形成細(xì)胞24小時(shí)，用無血清角質(zhì)細(xì)胞專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性；凍存角質(zhì)形成細(xì)胞以保證以后所有實(shí)驗(yàn)使用的角質(zhì)形成細(xì)胞來源于同一批次。 7.組織工程皮膚的構(gòu)建及移植。分別以毛囊隆突細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞作為組織工程真皮種子細(xì)胞，以膠原包被聚羥

9、基乙酸和異種脫細(xì)胞真皮為真皮支架，覆蓋角質(zhì)細(xì)胞膜片體外構(gòu)建組織工程復(fù)合皮。依據(jù)真皮種子細(xì)胞和支架的不同共分為4組：A組，毛囊隆突細(xì)胞+毛乳頭細(xì)胞+聚羥基乙酸；B組，毛乳頭細(xì)胞+聚羥基乙酸；C組，毛囊隆突細(xì)胞+毛乳頭細(xì)胞+脫細(xì)胞真皮；D組，毛乳頭細(xì)胞+脫細(xì)胞真皮。將以上四組組織工程復(fù)合皮移植于裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，分別于2w、4w、6w活檢，病理切片觀察再生皮膚結(jié)構(gòu)、附屬器官修復(fù)及支架降解情況；A組和C組移植后6w活檢標(biāo)本進(jìn)行掃描電鏡觀察

10、支架降解和細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 研究結(jié)果: 1.與傳統(tǒng)的機(jī)械分離法相比，改進(jìn)的膠原酶消化法分離毛囊隆突的效率可以提高10倍以上，且組織貼壁快，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，但毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞污染多，利用胰蛋白酶消化和Ⅳ型膠原快速粘附可以使細(xì)胞純化。傳代培養(yǎng)中，使用補(bǔ)充的無血清培養(yǎng)基可使隆突細(xì)胞傳代5-7代，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)基下細(xì)胞可傳3-5代；改進(jìn)培養(yǎng)方法培養(yǎng)的毛囊隆突細(xì)胞克隆形成率為18.2％、G1期細(xì)胞88.2％、免疫組化染色結(jié)果細(xì)胞K

11、19、K15表達(dá)陽性。 2.利用二步消化法分離培養(yǎng)的人胎兒毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)與成纖維細(xì)胞無明顯差別，但呈聚集性生長(zhǎng)，免疫組化染色結(jié)果顯示α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)陽性；凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活力沒有明顯變化；與毛囊隆突細(xì)胞共培養(yǎng)7d左右，毛乳頭細(xì)胞成旋渦狀圍繞于隆突細(xì)胞克隆周圍，3w左右，在克隆中心可見黑褐色毛囊樣結(jié)構(gòu)。 3.毛囊隆突細(xì)胞經(jīng)3-甲基-1-異丁基黃嘌呤+胰島素+地塞米松誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)1w后，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞核邊

12、集，并出現(xiàn)特征性“扇貝”形細(xì)胞。誘導(dǎo)2w后，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒和液滴，誘導(dǎo)4w后，伸展的細(xì)胞相互融合，包裹形成不規(guī)則的網(wǎng)格狀。而未加誘導(dǎo)劑組細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)在克隆中心出現(xiàn)細(xì)胞的堆積，分層。誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)2w后油紅染色、抗上皮膜抗原免疫組化染色結(jié)果呈陽性。 4.毛乳頭細(xì)胞在聚羥基丁酯材料浸提液中生長(zhǎng)良好，符合細(xì)胞正常的生長(zhǎng)曲線，在培養(yǎng)不同時(shí)間里與對(duì)照組細(xì)胞MTT值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；細(xì)胞接種4小時(shí)后與材料的粘附率為79.06％；接種1w后掃描

13、電鏡觀察見細(xì)胞已完全伸展，符著牢固。 5.隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，毛乳頭細(xì)胞在聚羥基乙酸浸提液和新鮮培養(yǎng)基中均出現(xiàn)增殖，并符合正常的生長(zhǎng)曲線，在培養(yǎng)后24h，48h和72h里兩組細(xì)胞MTT值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；毛乳頭細(xì)胞接種于膠原包被的聚羥基乙酸支架后24小時(shí)的黏附率為28.6％，而與單純聚羥基乙酸支架中的黏附率為10.3％，兩者有顯著差異；接種1w后H.E染色和掃描電鏡觀察可見細(xì)胞與材料黏附生長(zhǎng)；生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示聚羥基丁酯支架最大載

14、荷及抗拉強(qiáng)度較小，彈性差，硬度高，聚羥基乙酸支架具有較好的載荷和斷裂伸長(zhǎng)率，但兩者最大載荷、抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均小于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。 6.人胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞體外用無血清培養(yǎng)基可傳代培養(yǎng)10代以上，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，污染少，凍存、復(fù)蘇后細(xì)胞活力與新鮮標(biāo)本無明顯差異。 7.不同組織工程皮膚均能修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損，以脫細(xì)胞真皮支架組創(chuàng)面收縮明顯；不同時(shí)間病理切片顯示，與單純接種毛乳頭細(xì)胞相比，接種隆突細(xì)胞的復(fù)合皮能夠形成基底膜

15、的丁突和新生毛囊樣結(jié)構(gòu)；聚羥基乙酸支架移植后降解較慢，炎癥反應(yīng)重。術(shù)后6w掃描電鏡觀察結(jié)果顯示支架不同程度的降解，細(xì)胞在支架中浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。 研究結(jié)論: 1.改進(jìn)的膠原酶一步消化法可以快速、高效的分離培養(yǎng)人毛囊隆突細(xì)胞；利用改進(jìn)培養(yǎng)基和Ⅳ型膠原快速粘附可以有效純化隆突細(xì)胞并保持其干細(xì)胞特性。 2.毛囊隆突細(xì)胞在一定微環(huán)境下有向毛囊、皮脂腺上皮細(xì)胞分化的潛能。 3.人工合成的聚羥基丁酯，聚羥基乙酸材料具有良好

16、的組織相容性，但在生物力學(xué)、炎癥反應(yīng)等方面與異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)有一定差距，需要進(jìn)一步改性處理。 4.以角質(zhì)形成細(xì)胞、毛囊隆突細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞為種子細(xì)胞，以聚羥基乙酸或脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為支架構(gòu)建組織工程皮膚可以有效修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損，其中毛囊干細(xì)胞參與了創(chuàng)面的修復(fù)同時(shí)引導(dǎo)正常結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。 創(chuàng)新點(diǎn): 1.改進(jìn)了傳統(tǒng)機(jī)械分離毛囊隆突細(xì)胞和傳代培養(yǎng)方法，提高了分離效率和傳代次數(shù)，Ⅳ型膠原快速粘附法富集毛囊隆突細(xì)胞有