阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞的分離鑒定及轉(zhuǎn)錄因子Sox9對其作用機(jī)理的研究.pdf

1、毛囊是一個動態(tài)的微小器官。它不僅具有預(yù)防皮膚組織受損、感覺和免疫防護(hù)等重要功能，且獲取方便。毛囊組織中含有與自我更新、分化、調(diào)控毛發(fā)生長相關(guān)的多種干細(xì)胞，維持著皮膚的體內(nèi)平衡。而毛囊的發(fā)生和再生都離不開毛囊干細(xì)胞。毛囊干細(xì)胞的生物學(xué)研究日漸成為毛囊領(lǐng)域、皮膚學(xué)領(lǐng)域、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿。
　　轉(zhuǎn)錄因子Sox9，在胚胎發(fā)育、三胚層分化、胚胎干細(xì)胞和多種成體干細(xì)胞的維持、先天性疾病等重要的生物學(xué)過程中具有重要的功能。近幾年發(fā)現(xiàn)，在早期胚

2、胎生發(fā)板形成和毛囊發(fā)生中，Sox9有著至關(guān)重要的作用。
　　目前，國際上對小鼠和人的毛囊干細(xì)胞研究較多，對家畜動物毛囊干細(xì)胞的研究甚少。在本研究中，我們首次在體外分離鑒定了阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞(gHFSCs)，并對其進(jìn)行了多能性分析;初步驗證了Sox9在gHFSCs中的功能;并且進(jìn)行了Sox9染色質(zhì)共沉淀(ChIP)，以期研究其在gHFSCs中的作用機(jī)制，為今后絨山羊毛囊生長及其調(diào)控機(jī)理的研究提供實驗材料和依據(jù)。
　　一

3、、阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞(gHFSCs)的體外分離培養(yǎng)及鑒定
　　我們利用組織貼壁培養(yǎng)法在體外分離gHFSCs，對其進(jìn)行純化。從細(xì)胞形態(tài)、特異標(biāo)記、增殖能力、體外分化能力等方面對其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示:實驗所得到的細(xì)胞較小，呈典型的鵝卵石樣，折光度高且貼附能力強(qiáng)，符合毛囊干細(xì)胞的形態(tài)特征，且在體外培養(yǎng)至20代未出現(xiàn)明顯形態(tài)變化。免疫組化染色顯示，gHFSCs陽性表達(dá)毛囊干細(xì)胞標(biāo)記分子Krt15、Krt19、CD34、Itgβ1和

4、Krt14。CD34在gHFSCs中FACS(fluorescence-activated cell sorting)陽性率為99.8％。從細(xì)胞生長曲線可以看出，分離得到的gHFSCs具有較強(qiáng)的增殖能力。在轉(zhuǎn)錄水平上Krt14和CD34高表達(dá)(p＜0.01)，分別為絨山羊角質(zhì)細(xì)胞的39.68倍和24.37倍，Krt15的表達(dá)量為5.62倍，Itgβ1表達(dá)量低(p＜0.01)，為1.81倍。同樣Western blot檢測到了以上特異標(biāo)記

5、蛋白在gHFSCs中表達(dá)。體外成骨誘導(dǎo)后，Von Kossa法染色呈陽性;成軟骨誘導(dǎo)阿爾新藍(lán)染色為陽性;成肌誘導(dǎo)后Hoechst33342染色觀察到細(xì)胞融合現(xiàn)象，免疫組化染色檢測到成績誘導(dǎo)細(xì)胞MyoG表達(dá)呈陽性。
　　二、阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞(gHFSCs)的多能性分析
　　我們對gHFSCs中與干細(xì)胞多能性建立和維持及自我更新能力相關(guān)的幾個因子Oct4、Nanog、 Sox2、AKP和TERT等，通過細(xì)胞免疫組化、FA

6、CS、Q-PCR和Western blot的方法進(jìn)行了的檢測。結(jié)果表明:細(xì)胞免疫組化染色顯示Oct4、Nanog、Sox2、AKP和TERT等五個因子均在gHFSCs中陽性表達(dá);Oct4、Nanog和Sox2在gHFSCs中FACS陽性率在99.9％以上;與阿爾巴斯絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(gADSCs)對比，在轉(zhuǎn)錄水平上，gHFSCs中Oct4高表達(dá)，為對照細(xì)胞的41.36倍;Nanog、AKP、TERT中等表達(dá)，分別為對照組的5.61

7、倍、2.74倍和2.10倍(p＜0.01）;在蛋白水平，Oct4、Nanog、AKP和TERT的相對表達(dá)量，分別為對照組的5.94倍、10.78倍、1.33倍和1.39倍。Sox2在gHFSCs中mRNA和蛋白水平均表達(dá)，而在gADSCs中均不表達(dá)。
　　三、Sox9在阿爾巴斯絨山羊毛囊干細(xì)胞(gHFSCs)中的功能驗證
　　通過毛囊(gHF)冰凍切片和細(xì)胞免疫組化、Q-PCR、Western blot檢測Sox9在gHF和

8、gHFSCs中的表達(dá);利用shRNA載體，干擾gHFSCs中Sox9的表達(dá)，對與細(xì)胞增殖分化相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)變化的檢測;對gHFSCs特異標(biāo)記和干細(xì)胞多能因子在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)變化進(jìn)行檢測;鈣誘導(dǎo)培養(yǎng)后，對gHFSCs中Sox9和Loricrin(Lor)的表達(dá)變化進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果顯示:Sox9在gHF整個外根鞘部位都有表達(dá)，在隆突部表達(dá)比其他部位強(qiáng)，在毛母質(zhì)中也有少量表達(dá)，既Sox9主要在隆突部集中

9、表達(dá);在體外培養(yǎng)的gHFSCs呈Sox9陽性，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都有不同程度的表達(dá);Q-PCR和Western blot進(jìn)一步驗證了Sox9在gHFSCs中的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　Sox9-shRNA的干擾效率達(dá)到了53.58％。干擾Sox9表達(dá)之后:細(xì)胞增殖緩慢，無法進(jìn)入對數(shù)生長期，隨著生長周期，凋亡細(xì)胞增多;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，干擾Sox9表達(dá)后的gHFSCs無法完成從S期到G2/M期的過渡;Q-PCR檢測與

10、對照組相比發(fā)現(xiàn)，p21和細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)量顯著減少(p＜0.01)，p53表達(dá)無顯著差異(p＞0.05)，皮膚細(xì)胞終末分化標(biāo)記Lor表達(dá)量顯著增加(p＜0.01);gHFSCs不僅失去了毛囊干細(xì)胞形態(tài)特征，其特異標(biāo)記Krt15、Krt19、Krt14、CD34和Itgβ1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量均大幅降低(p＜0.01);與干細(xì)胞多能性和自我更新能力相關(guān)的因子Oct4、Nanog、Sox2、AKP和TERT的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄

11、水平和蛋白水平表達(dá)量均急劇減少(p＜0.01);低鈣培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，而高鈣誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化，呈長梭形。Western blot蛋白條帶可以看出，高鈣誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中Sox9表達(dá)量減少，而低鈣和正常培養(yǎng)的細(xì)胞中無明顯變化;高鈣誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞中Lor表達(dá)量增多，在低鈣和正常培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)量很少。
　　四、ChIP結(jié)合ChIP-seq尋找Sox9結(jié)合的基因
　　ChIP是目前研究體內(nèi)蛋白與DNA相互作用的

12、唯一手段。我們在前三章內(nèi)容的基礎(chǔ)上，對gHFSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子Sox9-ChIP得到蛋白-DNA復(fù)合物，利用ChIP-seq進(jìn)行測序，獲得與Sox9互作的基因信息。
　　結(jié)果顯示:對超聲破碎效果良好的蛋白-DNA復(fù)合物進(jìn)行純化測序，ChIP-seq測序后得到了共10736個MACS-peaks和峰的位置信息。其中位于外顯子區(qū)(exonic)的有2008個，內(nèi)含子(intronic)區(qū)有2827個，基因間(intergenic)區(qū)有

13、5433個，下游(downstream)區(qū)域有48個，上游(upstream)區(qū)域有61個，3'端非翻譯區(qū)(UTR3)有292個，端非翻譯區(qū)(UTR5)有28個，剪接(splicing)區(qū)有39個;利用de novo finding找到了36個未知的motif信息，通過轉(zhuǎn)錄因子motif數(shù)據(jù)和GO數(shù)據(jù)庫比對得出96個已知的motif。Top motifs中排列第一的基序與Sox9 invitro motif匹配。已知motif比對中包括

14、明確的胚胎發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Nanog、Oct4、Sox2、Tcf;對測序得到的所有基因進(jìn)行KEGG-pathway分析，跟據(jù)GO和KEGG中已有的信息共得到278條通路。其中p值小于0.05(p＜0.05)的通路有FoxO信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、干細(xì)胞多能性調(diào)控通路和細(xì)胞骨架肌動蛋白調(diào)控通路等24條通路;p值小于0.01(p＜0.01)的通路有黏著斑(Focal adhesion)、粘著連接(Adherens ju