脫細胞真皮在眼瞼再造中的應(yīng)用研究.pdf

1、脫細胞真皮是經(jīng)過特殊的處理方法使皮膚中主要引起免疫反應(yīng)的細胞成分脫去，留下基底膜和真皮中的膠原基質(zhì)。膠原的特殊結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)上的優(yōu)勢使膠原在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。脫細胞真皮膠原的這種優(yōu)勢來源于它獨特的結(jié)構(gòu)、生化及生物學性質(zhì)。主要特點有：(1)低免疫原性，(2)膠原材料與宿主細胞及組織之間良好的相互作用，(3)膠原對血小板具有凝聚作用，可形成血栓阻止流血，(4)天然膠原纖維的有序纖維狀結(jié)構(gòu)，(5)膠原是為結(jié)締組織提供強度的主要

2、蛋白成分，因而可以在廣泛范圍內(nèi)滿足機體對機械強度的要求。此外，膠原蛋白中還含有豐富的甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸，其水解產(chǎn)物中還存在有生理活性肽等等。目前，以脫細胞真皮為主的細胞外基質(zhì)已在眼整形手術(shù)中得到了較為廣泛的應(yīng)用。但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)脫細胞真皮在植入體內(nèi)后仍有一定程度的收縮，另外傳統(tǒng)的瞼板替代材料如異體鞏膜植入體內(nèi)后降解速度較快的原因國內(nèi)未有明確的解釋。因此本研究探索了將皮膚制備成脫細胞基質(zhì)的方法，對真皮膠原蛋白的不同的化學交聯(lián)方法，

3、找出最適的交聯(lián)條件，如pH值、濃度及所用溶劑等要素，以交聯(lián)后的膠原片的熱收縮轉(zhuǎn)變溫度，降解時間和質(zhì)量損失為指標進行觀察。從免疫學方面分析植入兔眼瞼后脫細胞真皮和異體鞏膜的轉(zhuǎn)歸，同時在臨床上觀察了脫細胞真皮在眼瞼修復(fù)中的效果。 第一部分同種異體人脫細胞真皮的制備、保存與鑒定 目的:以不同方法制備脫細胞真皮，比較不同方法、濃度、作用時間對皮膚脫細胞效果的差異，找到適合眼瞼再造的皮膚脫細胞方法。 方法: 將取自

4、病原體篩查的人尸體皮膚用鼓式取皮機反取法切下帶部分真皮組織的皮膚，經(jīng)0.01mmol/LTris-HCI緩沖液振蕩后分別用0.5％(A)、1.0％(B)、2.0％(C)、4.0％(D)的TrintonX-100溶液脫去細胞，然后將組織胃于0.1％SDS溶液中振蕩24小時并再將其按序放入200μg/mlDNA酶和20μg/mlRNA酶溶液中，于常溫條件下分別振蕩2h。另一組為將剪切好的皮膚分別置于含有0.25％的胰蛋白酶(Trypsin)

5、0.37％EDTA溶液中24(E)或48小時(F)，再將其按序放入200μg/mlDNA酶和20μg/mlRNA酶溶液中，于常溫條件下分別振蕩2h。制成的材料凍干并經(jīng)γ射線消毒保存。鑒定方法包括常規(guī)HE染色，透射電鏡(transmissionelectronmicroscopy,TEM)檢查，細菌培養(yǎng)試驗。 結(jié)論:以TrintonX-100處理的脫細胞真皮結(jié)構(gòu)緊湊，膠原纖維保存完好，其中2％TrintonX-100處理的材料組織

6、殘留細胞少，是一種適合在眼瞼再造中代替瞼板材料的皮膚脫細胞處理的方法。 第二部分脫細胞真皮膠原體外交聯(lián)的初步研究 目的:研究碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞氨(NHS)對脫細胞真皮膠原的交聯(lián)效果，找出最適合的交聯(lián)條件。 方法: 將未交聯(lián)的脫細胞真皮分別放入EDC對COOH的摩爾比分別設(shè)定在5:1，4:1，3:1，2:1，1:1的EDC和EDC與NHS混和的溶液中，同時對溶液設(shè)置不同的pH值，金屬離子

7、，反應(yīng)時間等參數(shù)。以樣品收縮轉(zhuǎn)變溫度，掃描電鏡組織學檢查，材料含水量分析，樣品力學性能，體外膠原酶消化溶解試驗來測定脫細胞真皮的交聯(lián)程度。 結(jié)論: EDC和NHS的聯(lián)合作用提高了對脫細胞真皮膠原的交聯(lián)速率和交聯(lián)程度，同時交聯(lián)的材料有較好的柔韌性。體外試驗表明在酶降解過程中可保留較高的抗張強度。 第三部分脫細胞真皮和異體鞏膜在兔眼瞼重建模型中的實驗觀察 目的:探討脫細胞真皮和異體鞏膜在修補兔眼瞼瞼板缺損中的

8、轉(zhuǎn)歸過程和組織相容性。 方法: 取體重約2.5Kg的新西蘭白兔16只，隨機分成兩組，在兔右下瞼中央切除瞼板約10×4mm，缺損區(qū)植入保存的兔脫細胞真皮和異體鞏膜，術(shù)后觀察植入?yún)^(qū)域的炎癥反應(yīng)，瞼結(jié)膜能否在植入物表面生長，觀察兩種材料的成形性能。分別于術(shù)后1周，4周，8周及12周取出標本，作組織學及免疫組化檢查。血液學檢查觀察抗體和CD4,CD8細胞的變化。 結(jié)論: 脫細胞真皮是一種較好的瞼板組織替代物，具有

9、一定的柔韌性，可任意剪裁，引起的免疫反應(yīng)輕微，作為一種細胞外基質(zhì)，可引導自身組織的膠原纖維長入。而異體鞏膜植入后較快吸收的原因可能是由于存在較強的免疫和炎癥反應(yīng)。 第四部分脫細胞真皮在眼瞼臨床修復(fù)技術(shù)中的初步探討 一、脫細胞真皮在眼瞼原位重建術(shù)中的臨床觀察 目的:探討脫細胞真皮作為瞼板替代物在眼瞼重建術(shù)中的臨床效果方法1.研究對象：不同原因?qū)е碌难鄄€缺損29例31只眼瞼，男性19例，女性10例，年齡從12歲到47

10、歲，平均32歲?；瘜W燒傷19例，熱燒傷8例，機械傷1例，先天性畸形1例。 2.手術(shù)方法: 離瞼緣3mm平行全長切開皮膚，分離眼輪匝肌，將殘留的瞼板連帶瞼結(jié)膜中央剖開，分離穹隆部結(jié)膜使其松解，如有較多結(jié)膜缺損則在中間縫合一塊羊膜或唇粘膜，將制作的脫細胞真皮浸入帶抗生素的生理鹽水中5分鐘，基底膜面朝向眼球表面縫合于下方殘留的瞼板，修復(fù)上瞼時將脫細胞真皮上緣與提上瞼肌斷端縫合，兩側(cè)與內(nèi)外眥韌帶縫合，然后將分離的眼輪匝肌覆蓋于供

11、體表面，如合并有眼瞼前層皮膚缺損，則用游離的中厚皮瓣作荷包式縫合。 結(jié)果: 隨訪5-25個月，平均14個月。31只眼瞼中，治愈18只瞼(58％)，顯效10只瞼(32％)，改善3只瞼(10％)，無手術(shù)失敗者，以先天性眼瞼缺損，機械傷及輕度眼瞼燒傷的效果較好。 結(jié)論: 脫細胞真皮材料容易獲得，避免了第二手術(shù)切口及縮短手術(shù)時間，經(jīng)硬化處理的脫細胞真皮復(fù)水后具有較好的可塑性和彈性，另外光滑的基底膜面可使結(jié)膜上皮化

12、快速進行。由于脫去了細胞成分，不僅引起的免疫反應(yīng)很輕微，也大大減少了病毒寄宿的環(huán)境。在我們所做的短期臨床觀察中，脫細胞真皮可基本起到支撐眼瞼后層的支架作用。 二、脫細胞真皮在疤痕性瞼內(nèi)翻中的臨床觀察 目的:探討脫細胞真皮在疤痕性瞼內(nèi)翻中的治療效果方法1.研究對象：不同原因?qū)е碌陌毯坌圆€內(nèi)翻患者42例，其中男性24例，女性18例，年齡從11歲至68歲，平均年齡為36歲。其中熱燒傷患者12例，化學傷患者20例，沙眼導致的疤痕

13、性瞼內(nèi)翻10例。 2.手術(shù)方法：上瞼的疤痕性矯正術(shù)為距瞼緣3mm平行瞼緣全長切開皮膚，向下分離瞼板前的眼輪匝肌，充分暴露疤痕化的瞼板組織。用刀片在瞼板水平中線兩側(cè)各作-45°角的切口，尖端向結(jié)膜，底寬2～3衄，長度為瞼板全長。用6-0可吸收線間斷縫合瞼板切口4～5針，用5-0絲線由皮膚切口下緣1mm處進針，出針后水平經(jīng)過瞼板切口上緣，由皮膚切口上緣出針，一般縫合5～7針。然后用用瞼板夾或較大的霰粒腫央，將手術(shù)部位的瞼緣夾緊固定，

14、沿緣間灰線切開，其長度應(yīng)略較倒睫范圍較長，必須將所有的倒睫包括在內(nèi)。先用尖刀片垂直切開緣間部灰線深約0.5～1.0mm，然后細心向深部分離，在灰線處將眼瞼剖開為前后兩層，深度約2～3mm。此時將脫細胞真皮切成底部寬為1mm的楔形條狀物嵌入切開的瞼緣前后唇之間。楔形脫細胞真皮底部形成新的瞼緣，如果切口長度超過1cm，緣間切口應(yīng)使用10-0尼龍線連續(xù)縫合以固定充填物。植入脫細胞真皮時不宜過深或過淺，過深則緣間切口張開效果較差，或切口很快重新

15、愈合；過淺則植入物突出緣間部易脫落或引起眼部不適感。植入充填物底部應(yīng)與緣問部處于同一水平為宜。術(shù)畢于眼部涂抗生素眼膏，約于術(shù)后10天可拆除10-0尼龍線。 結(jié)果: 隨訪期限為5個月至23個月，平均隨訪時間為9個月。在隨訪期間，按手術(shù)成功標準有74只眼瞼恢復(fù)了正常的解剖位置，另外10例未達到預(yù)期目標，成功率為88％。失敗的原因部分為由于需緊急保護角膜而在炎癥期施行的手術(shù)，另外一個重要原因是失敗的病例全部是重型的疤痕性瞼內(nèi)翻