miRNAs在變性真皮及熱損傷成纖維細胞-HUVECs中表達及功能的研究.pdf

1、目的：
　　采用基因芯片的方法篩選燒傷患者變性真皮較正常皮膚中差異表達的miRNAs，然后預測其靶基因以及對變性真皮可能起保護作用的信號通路;挑選出在細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用的miR-199a-5p及miR-126，檢測其在大鼠變性真皮中的表達規(guī)律;深入研究miR-199a-5p在熱損傷成纖維細胞、miR-126在熱損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVECs）轉(zhuǎn)歸中的作用，并探討其可能的機制。
　　方法:
　　1.收集

2、深二度燒傷患者的變性真皮及配對正常皮膚，標本收集時間均為患者燒傷后第四天，采用高通量miRNA芯片技術(shù)初步篩選出變性真皮較正常皮膚差異表達的miRNAs。在另一組標本中應用QRT-PCR技術(shù)檢測部分差異表達的miRNAs，驗證芯片結(jié)果的準確性。使用生物信息學方法預測其靶基因以及對變性真皮可能起保護作用的信號通路。篩選出與芯片結(jié)果一致并且在細胞增殖和遷移中發(fā)揮重要作用的miRNAs（miR-199a-5p和miR-126）進行下一步實驗。

3、
　　2.建立大鼠深二度燙傷模型，檢測miR-199a-5p和miR-126在大鼠變性真皮恢復不同時間（燙傷后1天、3天、5天、7天、14天）的表達情況，以大鼠正常皮膚做為對照。
　　3.建立成纖維細胞熱損傷模型(52°，30s)，應用QRT-PCR技術(shù)檢測miR-199a-5p在成纖維細胞熱損傷后恢復不同時間(損傷2h、24h、48h)的表達情況，以正常成纖維細胞做為對照。成纖維細胞轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物和抑制物

4、后進行熱損傷預處理，采用MTT法、細胞劃痕試驗及Transwell實驗檢測miR-199a-5p對熱損傷成纖維細胞增殖遷移能力的影響。
　　4.建立HUVECs熱損傷模型(52°，30s)，應用QRT-PCR技術(shù)檢測miR-126在HUVECs熱損傷后恢復不同時間（損傷2h、12h、24h）的表達情況，以正常HUVECs做為對照。HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和抑制物后進行熱損傷預處理，采用MTT法、細胞劃痕試驗及Trans

5、well實驗檢測miR-126對熱損傷HUVECs增殖遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，燒傷患者的變性真皮相對正常皮膚差異表達的miRNAs有66個，其中34個顯著下調(diào)，32個顯著上調(diào)，上調(diào)比較明顯的有miR-223、miR-320c，下調(diào)比較明顯的是miR-203、miR-126、miR-199a-5p。通過生物信息學方法對差異表達的miRNAs進行預測，發(fā)現(xiàn)16個與創(chuàng)面修復密切相關(guān)的信號通路

6、(如Apoptosis、Calciumsignalingpathway、Celladhesionmolecules、Cellcycle)，它們可能在變性真皮轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。
　　2.動物實驗結(jié)果顯示:miR-199a-5p在大鼠變性真皮中早期呈低表達，3天降低最明顯，之后不斷升高，于第7天基本恢復正常;miR-126在大鼠變性真皮中也明顯低表達，但于第5天基本恢復正常，之后繼續(xù)升高，第14天增高為正常皮膚的5倍。
　　3

7、.成纖維細胞熱熱損傷后24小時miR-199a-5p的表達量降低為正常成纖維細胞的10％，于48小時基本恢復正常。成纖維細胞分別轉(zhuǎn)染miR-199a-5p模擬物和抑制物后進行熱損傷預處理，MTT結(jié)果顯示:與對照組相比，miRNA-199a-5p抑制物組的細胞生長明顯較快(P＜0.05)，在熱損傷后48小時、72小時表現(xiàn)均明顯;細胞劃痕實驗顯示:miRNA-199a-5p抑制物組的細胞遷移較快，遷移距離較遠(P＜0.05);transwe

8、ll實驗結(jié)果顯示:miRNA-199a-5p抑制物組的細胞遷移數(shù)量明顯高于對照組(P＜0.05)。而miRNA-199a-5p模擬物組各項實驗數(shù)據(jù)與對照組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.HUVECs熱損傷后2小時miR-126的表達量降到正常HUVECs的40％，但是12小時便升高到正常HUVECs的2倍，24小時達到正常HUVECs組的7倍。HUVECs轉(zhuǎn)染miR-126模擬物和抑制物后進行熱損傷預處理，MTT結(jié)果顯示:

9、與對照組相比，miRNA-126模擬物組細胞的生長明顯較快，尤其在24小時、48小時表現(xiàn)明顯(P＜0.05);細胞劃痕實驗顯示:miRNA-126模擬物組細胞遷移較快，遷移距離較遠;transwell實驗結(jié)果顯示:miRNA-126模擬物組細胞遷移數(shù)量明顯多于對照組(P＜0.05)。而miRNA-199a-5p抑制物組實驗數(shù)據(jù)與對照組無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.篩選出燒傷患者變性真皮較正常皮膚差異表達的

10、miRNAs，并預測出Apoptosis、Calciumsignalingpathway、Celladhesionmolecules、Cellcycle等16個對變性真皮可能起保護作用的信號通路，為進一步探討變性真皮轉(zhuǎn)歸的機制提供了新的思路。
　　2.miR-199a-5p和miR-126在大鼠變性真皮中的表達均呈時間依賴性改變。損傷早期miR-199a-5p和miR-126均表達下降、然后逐漸恢復正常，不同的是損傷后期miR-1