IL-10-hAMSCs的構(gòu)建及其對小鼠創(chuàng)面愈合中TGF-β1、MMP-1及TIMP-1影響研究.pdf

1、目的：
　　探討IL-10基因修飾的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（IL-10-hAMSCs）在創(chuàng)面愈合過程中的促創(chuàng)面愈合作用及其與瘢痕形成相關(guān)因子TGF-β1、MMP-1及TIMP-1表達(dá)變化的關(guān)系，為今后IL-10-hAMSCs促進(jìn)創(chuàng)面愈合、減輕創(chuàng)面纖維化的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用機(jī)械分離聯(lián)合胰酶-膠原酶二步消化法從人羊膜分離提取hAMSCs，用含10％FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，置37℃、5%

2、CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，并傳至3代備用。
　　2、將克隆的小鼠IL-10基因鏈接到LV5載體中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，在293T細(xì)胞中包裝LV5-IL-10慢病毒載體，再轉(zhuǎn)染hAMSCs，獲得IL-10-hAMSCs，熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白報告基因表達(dá)情況觀察、評估病毒轉(zhuǎn)染情況及轉(zhuǎn)染效率。
　　3、取第3代生長活躍的hAMSCs、IL-10-hAMSCs和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs，用ELISA試劑

3、盒對上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行TGF-β1分泌量的檢測分析。
　　4、取7周齡C57BL/6野生型雄性小鼠100只，隨機(jī)分為空白組、模型組、hAMSCs組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hAMSCs組、IL-10轉(zhuǎn)染hAMSCs組，每組20只。腹腔麻醉后，在小鼠背部中線兩側(cè)分別制作1cm×1cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，根據(jù)分組不同，在創(chuàng)面建立即刻于每個創(chuàng)面周圍皮下多點（創(chuàng)緣各邊中點距創(chuàng)面1mm處）注射100μL PBS懸浮的不同組別的hAMSCs（細(xì)

4、胞總數(shù)為1×106個），模型組小鼠則注射等量的PBS，空白組為不進(jìn)行造模及干預(yù)的正常小鼠。另取3只模型小鼠，分別注射IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs和CM-Dil標(biāo)記的hAMSCs，用于熒光示蹤移植細(xì)胞的定植存活情況。
　　5、細(xì)胞移植后1天、3天、7天、14天分別觀察各組小鼠創(chuàng)面的紅、腫、滲出及創(chuàng)面愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率。再對各時間點切取的創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織，分別進(jìn)行石蠟切片HE染色觀察創(chuàng)面及創(chuàng)緣炎性細(xì)胞的浸潤情況；

5、Masson染色觀察創(chuàng)面及創(chuàng)緣膠原沉積情況，計算膠原容積分?jǐn)?shù)；免疫組化觀察TGF-β1、MMP-1、TIMP-1表達(dá)情況；ELISA觀察創(chuàng)面創(chuàng)緣組織中TGF-β1、MMP-1、TIMP-1含量；qPCR檢測創(chuàng)面創(chuàng)緣組織TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、hAMSCs貼壁細(xì)胞形態(tài)為長梭形、多邊形，細(xì)胞間相互交聯(lián)，呈巢狀或漩渦狀排列。傳代后，細(xì)胞貼壁生長速度加快，24 h后即可完全貼壁

6、，細(xì)胞呈梭形，相互交聯(lián)緊密，成巢狀生長。
　　2、IL-10基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果顯示目的基因克隆存在，慢病毒滴度測定結(jié)果為1×108TU/ml，IL-10慢病毒及空質(zhì)粒感染hAMSCs72 h后于倒置顯微鏡下觀察可見視野中多數(shù)細(xì)胞均表達(dá)綠色熒光，表明感染率高。
　　3、細(xì)胞上清液ELISA結(jié)果顯示：培養(yǎng)基組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為0.47±0.34ng/L，0.33±0.22ng/L，0.27±

7、0.21ng/L，0.25±0.15ng/L。hAMSCs組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為3.26±0.26ng/L，6.37±0.34ng/L，9.86±0.43ng/L，9.08±0.50ng/L。IL-10-hAMSCs組TGF-β1分泌量1d、3d、7d、14d分別為6.35±0.48ng/L，10.2±0.54ng/L，14.96±0.67ng/L，13.92±0.41ng/L。空質(zhì)粒組TGF-β1分泌量1d

8、、3d、7d、14d分別為3.23±0.30ng/L，6.30±0.31ng/L，9.30±0.22ng/L，9.13±0.43ng/L。hAMSCs組及空質(zhì)粒組與IL-10-hAMSCs組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。hAMSCs組及空質(zhì)粒組之間無差異（P＞0.05）。提示體外培養(yǎng)過程中hAMSCs能分泌TGF-β1，IL-10可以促進(jìn)hAMSCs分泌TGF-β1。
　　4、小鼠背部全層皮膚缺損模型建立后1d、3d觀察I

9、L-10-hAMSCs組紅、腫、滲出弱于模型對照組、hAMSCs組、空質(zhì)粒組。7d觀察hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組的創(chuàng)面愈合速度快于模型對照組，紅、腫及滲出明顯減弱，且IL-10-hAMSCs組的愈合速度、紅、腫、滲出減弱強(qiáng)度均優(yōu)于hAMSCs組、和空質(zhì)粒-hAMSCs組。14d除模型對照組外，創(chuàng)面均100%愈合，且瘢痕增生程度小于模型對照組，IL-10-hASMCs組最優(yōu)。結(jié)果提示hAMSCs組、

10、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組-hAMSCs創(chuàng)面創(chuàng)面愈合優(yōu)于模型對照組，IL-10-hAMSCs組優(yōu)于hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組，以上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。hAMSCs利用CM-Dil染色， IL-10-hAMSCs及空質(zhì)粒-hAMSCs本身表達(dá)GFP，建模移植注射后14天取組織塊切取冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察可見散在熒光分布，表明hAMSCs、IL-10-hAMSCs及空質(zhì)粒-hAMSCs在

11、組織內(nèi)定植并存活。
　　5、HE結(jié)果提示：在顯微鏡下觀察正常小鼠皮膚組織HE染色，可見表皮完整，伴有毛囊，1d時觀察模型對照組、hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組的小鼠創(chuàng)面及創(chuàng)緣均可見大量炎性細(xì)胞浸潤，創(chuàng)面上方部分組織壞死結(jié)痂， IL-10-hAMSCs組炎性浸潤相比其他組稍少，3d時hAMSCs移植組、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組炎性細(xì)胞浸潤量明顯少于模型對照組，hAMSCs

12、組、空質(zhì)粒組、IL-10-hAMSCs組膠原形態(tài)較一致，間隙適中，模型對照組膠原大小不一，排列疏松且紊亂。7d時模型對照組仍有炎性細(xì)胞浸潤，且成纖維細(xì)胞數(shù)量大，膠原多且密集，hAMSCs移植組、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒組-hAMSCs炎性細(xì)胞浸潤較前降低，且均少于模型對照組，IL-10-hAMSCs組炎性浸潤程度最弱，成纖維細(xì)胞量最少，膠原排列有序；hAMSCs組、空質(zhì)粒組、IL-10-hAMSCs組膠原大小一致，模型對照組膠

13、原數(shù)量多排列紊亂。14d時模型對照組有少量炎性浸潤，hAMSCs移植組、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒組創(chuàng)面炎性細(xì)胞未見明顯炎性細(xì)胞，膠原形態(tài)一致，模型對照組成纖維細(xì)胞明顯多余其他三組。
　　在顯微鏡下觀察空白組正常小鼠皮膚組織Masson染色切片膠原纖維染呈藍(lán)色，排列有序，間隙適中。1d，各組均見大量壞死組織和炎性細(xì)胞浸潤。3d，模型對照組膠原數(shù)量少且間隙較寬，排列紊亂，大小不一，且大量炎性細(xì)胞浸潤，hAMSCs組、IL-1

14、0-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組相比模型對照組，數(shù)量多，呈絲條狀，排列相對有序。IL-10-hAMSCs組形態(tài)一致，交聯(lián)密切，容積分?jǐn)?shù)優(yōu)于其他三組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。7d，hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組較模型對照組膠原排列呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原間隙適中，數(shù)量稍有減少。模型對照組膠原纖維呈旋渦狀排列，紊亂無序，膠原粗大且數(shù)量多，膠原間隙致密，IL-10-hAMSCs組與其他三組相比

15、容積分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。14d，各組膠原均穩(wěn)定形成，相對于其它各組，模型對照組排列緊密，成纖維數(shù)量多，而IL-10-hAMSCs組成纖維細(xì)胞相對較少，膠原排列近似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、間隙適中，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.05）
　　免疫組化結(jié)果顯示：空白組正常小鼠皮膚可見少量TGF-β1、MMP-1、TIMP-1陽性表達(dá)，陽性結(jié)果均為胞漿棕黃色。TGF-β1結(jié)果：建模后1d、3d，模型對照組可見TGF-β1陽性率逐漸增

16、高，3d時，IL-10-hAMSCs組增高最明顯(P＜0.05)；建模后7d、14d，與模型對照組比較，hAMSCs、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒組TGF-β1陽性率明顯下調(diào)，7d、14d均為IL-10-hAMSCs組下降最明顯（P<0.05）。MMP-1結(jié)果：建模后1d、3d，各組見MMP-1陽性率逐漸升高，與空白組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；除空白組外四組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。建模后7d，與模型對照組比較

17、，hAMSCs、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組陽性率明顯增高，且IL-10-hAMSCs組增高最明顯（P<0.05），14d，各組陽性率均下降，模型對照組、hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組陽性率下降明顯，三組之間無差異（P＞0.05），但模型對照組、hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組與IL-10-hAMSCs組差異明顯（P＜0.05）。TIMP-1結(jié)果：1d、3d、7d，hAMSCs和IL-10-hAMSCs、

18、空質(zhì)粒-hAMSCs組、模型對照組含量逐漸升高，各時間點與空白組相比差異明顯（P＜0.05）。7d時，hAMSCs和IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組與模型對照組相比差異明顯（P＜0.05），IL-10-hAMSCs組與空質(zhì)粒組、hAMSCs組相比差異明顯（P＜0.05）。14d，模型對照組含量明顯增高，hAMSCs和IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組含量增高不明顯，與模型對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0

19、.05）。
　　6、ELISA法和qPCR檢測小鼠背部創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織結(jié)果顯示TGF-β1含量及mRNA相對表達(dá)量：結(jié)果可見空白組正常小鼠皮膚組織TGF-β1較低，1d、3d、7d模型對照組TGF-β1含量逐漸增高，7d達(dá)峰值后逐漸開始下降，hAMSCs和IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組較模型對照組1d、3d的TGF-β1明顯增高，且IL-10-hAMSCs組升高更明顯，7d時IL-10-hAMSCs組與空質(zhì)粒-hA

20、MSCs組、hAMSCs組TGF-β1明顯含量減少，IL-10-hAMSCs組減少最多，且三組含量均少于模型對照組，以上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示IL-10-hAMSCs在創(chuàng)面愈合過程的1d、3d促進(jìn)創(chuàng)面分泌TGF-β1，7d后可以抑制創(chuàng)面中的TGF-β1的分泌，使其減少。MMP-1濃度及mRNA相對表達(dá)量：結(jié)果可見空白組正常小鼠MMP-1含量較低，其余四組的MMP-1含量1d、3d逐漸增高，7d達(dá)峰值后逐漸開始下降。hA

21、MSCs和IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒組較模型對照組1、3、7d的MMP-1含量少，且IL-10-hAMSCs組含量最少，7d，四組MMP-1含量均增高，且IL-10-hAMSCs組與空質(zhì)粒-hAMSCs組、hAMSCs組、模型對照組相比，MMP-1含量明顯多于以上三組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明正常皮膚MMP-1表達(dá)極低。IL-10-hAMSCs可以增加創(chuàng)面MMP-1含量。TIMP-1濃度及mRNA相對表達(dá)量：結(jié)

22、果可見空白組正常小鼠TIMP-1含量較低，其余四組的TIMP-1含量逐漸增高，1、3、7d，hAMSCs和IL-10-hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs組較模型對照組的TIMP-1含量高。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），14d，模型對照組含量明顯增高，余三組含量增高不明顯，hAMSCs、IL-10-hAMSCs組、空質(zhì)粒-hAMSCs組與空白組及模型對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明正常皮膚TIMP-1表達(dá)極低。

23、IL-10-hAMSCs可以在創(chuàng)面中增高TIMP-1含量。TIMP-1/MMP-1比值：1d、7d時，各組比值相差不大，3d時，IL-10-hAMSCs比值大于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，（P＜0.05）；14d，IL-10-hAMSCs比值小于模型對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、創(chuàng)面形成后局部移植IL-10-hAMSCs可通過先升高后降低的方式影響創(chuàng)面TGF-β1表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，控