芍藥苷誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生.pdf

1、自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，自噬發(fā)生的重要特征為自噬體合成的增加，伴隨著LC3-I（微管相關(guān)蛋白-輕鏈3-I，microtubule-associated protein1 light chain3-I）向LC3-II（微管相關(guān)蛋白-輕鏈3-II，microtubule-associated protein1 light chain3-II）的轉(zhuǎn)化的增加，因此，LC3-II/LC3-I的比值是評(píng)價(jià)自噬發(fā)生及自噬水平高低的一個(gè)重要

2、指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)心臟、肺臟、腎臟等纖維化疾病中存在自噬不足現(xiàn)象，最近研究表明增生性瘢痕組織自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)水平較正常皮膚組織明顯降低。增生性瘢痕病理特征主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量合成及沉積，然而增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞的自噬水平尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)自噬的發(fā)生能抑制心、肺、腎等纖維化疾病的纖維化進(jìn)展，而自噬促進(jìn)劑能明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞增殖、遷移，并明顯減少α-SMA的表達(dá)。芍藥苷（paeoniflo

3、rin，PAE）是傳統(tǒng)中藥芍藥的主要單體活性成分。
　　本課題組前期研究表明芍藥苷能減少增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TGF-β1的自分泌和α-SMA的表達(dá)，從而抑制增生性瘢痕的發(fā)展，那么芍藥苷是否會(huì)影響增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬發(fā)生？新近研究表明在瘢痕成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2)的表達(dá)增加可引起I型膠原表達(dá)的下降，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在腎臟

4、纖維化中TIMP-2表達(dá)的增加和自噬的發(fā)生存在正相關(guān)關(guān)系，而自噬促進(jìn)劑能有效減少瘢痕成纖維細(xì)胞中I型膠原的表達(dá)。本課題組前期研究表明芍藥苷能有效減少增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中I型膠原的分泌，那么芍藥苷能否調(diào)節(jié)TIMP-2的表達(dá)？是否能通過(guò)影響自噬的發(fā)生從而影響TIMP-2的表達(dá)？相關(guān)研究表明p38MAPK和ERK1/2與增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，那么p38MAPK和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和芍藥苷影響成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生之間是否存在關(guān)

5、聯(lián)？
　　目的:探討芍藥苷誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生
　　方法:（1）收集增生性瘢痕組織及正常皮膚組織，采用組織塊法分離培養(yǎng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞，在不加任何刺激因素的情況下，Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中基礎(chǔ)條件下LC3和TIMP-2的表達(dá)情況；（2）分別加入不同濃度（0μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L）的芍藥苷培養(yǎng)24h，Western Blot檢

6、測(cè)兩種細(xì)胞中LC3、TIMP-2、p-p38MAPK、t-p38MAPK、p-ERK1/2和t-ERK1/2的表達(dá)情況；(3)加入400μmol/L的芍藥苷分別培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h。Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中LC3的表達(dá)情況；(4)加入400μmol/L芍藥苷，細(xì)胞培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，透射電鏡觀察細(xì)胞的自噬情況。
　　結(jié)果:（1）在不加任何刺激因素的情況下，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中LC3-II/

7、LC3-I的比值較正常成纖維細(xì)胞明顯降低（P<0.01）；（2）400μmol/L、800μmol/L的芍藥苷能增加增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的比值（P<0.05），而對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞作用尤為顯著（P<0.01）；（3）增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中 LC3-II/LC3-I的比值呈時(shí)間依賴(lài)性增加，24h達(dá)高峰；（4）未加任何刺激因素的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中未見(jiàn)自噬體和自噬溶酶體，而400μmol/L芍藥苷處

8、理細(xì)胞后，細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)明顯的自噬體和自噬溶酶體；（5）在不加任何刺激因素的情況下，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TIMP-2蛋白的表達(dá)量較正常皮膚成纖維細(xì)胞明顯升高；（6）增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞中 TIMP-2蛋白表達(dá)水平隨著芍藥苷濃度的增加呈濃度依賴(lài)性增加，其中400μmol/L、800μmol/L芍藥苷對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞影響顯著（P<0.01）；（7）增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中p-p38MAPK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)較正常皮膚

9、成纖維細(xì)胞中升高，而增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中 p-p38MAPK和 p-ERK1/2蛋白表達(dá)在不同濃度芍藥苷刺激后均有升高。
　　結(jié)論:（1）增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬水平較正常成纖維細(xì)胞降低；（2）一定濃度的芍藥苷能誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生；（3）一定濃度的芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TIMP-2的表達(dá)，而細(xì)胞自噬與TIMP-2高表達(dá)及膠原降解間的關(guān)系，需要進(jìn)一步研究；（4）一定濃度芍藥苷能增加增生性瘢痕成纖維細(xì)胞