TCTP在低劑量電離輻射適應(yīng)性反應(yīng)中的作用及機制研究.pdf

1、電離輻射（Ionizingradiation,IR）作為重要的醫(yī)療、科研、能源等手段被人類廣泛利用，盡管高劑量IR的致癌致畸等損傷效應(yīng)已經(jīng)明確，低劑量IR的生物學(xué)效應(yīng)是否可由高劑量區(qū)簡單外延卻始終是學(xué)術(shù)界爭論的焦點。隨著公眾暴露于低劑量IR的頻率迅速增加，建立合理有效的輻射風(fēng)險預(yù)測模型以及尋找可評估個體輻照敏感性的生物劑量計成為放射生物學(xué)界面臨的挑戰(zhàn)。
　　低劑量IR適應(yīng)性反應(yīng)（Adaptiveresponse,ARs）于1984

2、年在“Science”上首次被報道，是指機體/器官在受到低劑量輻照預(yù)刺激后，對繼發(fā)的內(nèi)源性損傷或高劑量IR損傷產(chǎn)生抗性。盡管大量研究認(rèn)為，ARs的產(chǎn)生與低劑量IR提高機體內(nèi)源的生理性DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)，但其分子機制尚未闡明。尋找特異性的低劑量IR保護性反應(yīng)蛋白不僅對于建立可評估個體輻照敏感性的生物劑量計具有重要意義，也將為揭示生物體生理性的內(nèi)源DNA損傷修復(fù)體系，進而闡明老化、退行性病變以及腫瘤發(fā)生等的原初機制提供新的思路和實驗

3、依據(jù)。
　　本研究通過先進的蛋白組學(xué)iTRAQ標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜定量分析技術(shù)全面對比分析了正常人體皮膚細(xì)胞受到低劑量輻照后的蛋白差異表達(dá)譜，在此基礎(chǔ)上篩選出對低劑量輻照最為敏感的高表達(dá)蛋白TCTP。進而，首次從量效反應(yīng)規(guī)律、蛋白功能、作用機制等方面全面探討了這一蛋白重要的放射生物學(xué)意義。研究結(jié)果不僅為尋找可用于評估放射敏感性的生物劑量計奠定了堅實基礎(chǔ)，也為深入揭示細(xì)胞生理性的內(nèi)源DNA損傷修復(fù)體系開拓了新的思路和領(lǐng)域。
　　方法：

4、
　　1.利用iTRAQ標(biāo)記和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)定量分析慢性低劑量（10cGy，0.2cGy/h）γ-射線輻照后，正常人體皮膚成纖維AG1522細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征。
　　2.篩選出低劑量輻照后表達(dá)改變最為顯著的蛋白TCTP，觀察離體培養(yǎng)的正常人體皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)，TCTP對不同劑量、不同類型IR及多種過氧化環(huán)境損傷因素的反應(yīng)敏感性，初步探討其反應(yīng)規(guī)律。
　　3.通過建立三維立體皮膚模型及動物實驗，驗證TCTP作為輻照敏感性指

5、示劑的可行性。
　　4.利用siRNA技術(shù)干擾AG1522細(xì)胞內(nèi)TCTP的表達(dá)后，通過微核形成（MicronucleusFormation,MN）評價輻照后DNA雙鏈斷裂（DNAdoublestrandbreaks,DSBs）及其修復(fù)情況、[3H]-thymidine標(biāo)定檢測G1/S阻滯間期，Western檢測DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白p53、p21WAF1的調(diào)控。同時，觀察低劑量輻照后細(xì)胞核內(nèi)的TCTP定位表達(dá)改變，明確TCTP在I

6、R致DNA損傷修復(fù)中的作用。
　　5.通過封閉內(nèi)源性蛋白合成、抑制蛋白酶解途徑，觀察低/高劑量輻照后TCTP的翻譯后修飾改變；利用多種DNA損傷修復(fù)抑制劑，篩選低劑量γ-輻照后，TCTP參與DNA損傷修復(fù)的相關(guān)調(diào)控通路;以ATM基因突變(ATM+/-,ATM-/-)的皮膚成纖維細(xì)胞為平臺，探討TCTP的放射敏感性反應(yīng)與ATM相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.iTRAQ-MS共篩選出22種蛋白對低劑量輻照的反應(yīng)具有高敏感性，

7、其中，TCTP的表達(dá)改變最為顯著。
　　2.低劑量/低LET輻照特異性地引起TCTP表達(dá)上調(diào)屬于正常人體皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的普遍性反應(yīng)。對比分析相同物理性質(zhì)的低LET射線（γ-或質(zhì)子）輻照后發(fā)現(xiàn)，10cGy均可引起TCTP蛋白表達(dá)顯著增加并可持續(xù)至照后24h，相反，4Gy高劑量輻照后，TCTP蛋白表達(dá)無變化甚至呈現(xiàn)降低趨勢；劑量-效應(yīng)關(guān)系分析表明，不同正常人體皮膚細(xì)胞（AG1522和GM5758）暴露于中低劑量γ-輻照（<50cGy

8、）后，TCTP均表達(dá)增加，暴露劑量>50cGy后，蛋白表達(dá)量逐漸降低。
　　3.三維皮膚成纖維細(xì)胞輻照模型及受照小鼠腦部、肺部均表現(xiàn)出TCTP對低劑量IR的高度反應(yīng)敏感性。利用細(xì)胞基質(zhì)生物碳支架（Cytomatrixcarbonscaffold，CCS）構(gòu)建三維皮膚成纖維細(xì)胞模型，經(jīng)過1-10cGyγ-輻照后發(fā)現(xiàn)，TCTP在低劑量輻照區(qū)具有高反應(yīng)敏感性。C3H/HeJ小鼠暴露于10cGyγ-輻照后，其腦部、肺部TCTP表達(dá)顯著增加

9、，4Gyγ-射線暴露未見類似反應(yīng)。
　　4.低劑量/低LET輻照導(dǎo)致的TCTP表達(dá)上調(diào)屬于氧化相關(guān)性調(diào)節(jié)。鑒于IR輻照屬于氧化相關(guān)性刺激因素之一，在對比分析其他氧化損傷（過熱、過氧化）因素后發(fā)現(xiàn)，低劑量刺激時，TCTP表達(dá)顯著上調(diào)；而高劑量損傷性刺激未見TCTP表達(dá)改變甚至出現(xiàn)下降，其變化趨勢類似于低LET的γ-或質(zhì)子輻照效應(yīng)。相反，非氧化相關(guān)因素UVC輻照后TCTP的表達(dá)未見改變。
　　5.低劑量γ-輻照引起AG1522細(xì)

10、胞內(nèi)TCTP蛋白的穩(wěn)定性增加；相反，高劑量輻照時TCTP發(fā)生降解。10cGyγ-輻照后，AG1522細(xì)胞內(nèi)的TCTP蛋白穩(wěn)定性增加；同時，4Gy輻照后，TCTP通過蛋白酶體途徑發(fā)生降解。
　　6.低劑量γ-輻照后，TCTP通過細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)直接參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)和輻照后p53的穩(wěn)定性調(diào)控，該反應(yīng)為ATM和其它PI3K家族成員依賴性，而p53、HDM2非依賴性。利用siRNA技術(shù)抑制AG1522細(xì)胞內(nèi)TCTP的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞暴露

11、于10cGyγ-輻照后p53蛋白的穩(wěn)定性受到嚴(yán)重影響，DNA雙鏈斷裂修復(fù)幾乎完全受阻；極低劑量1cGyγ-急性輻照，細(xì)胞核內(nèi)便可出現(xiàn)TCTP顯著高表達(dá)，證實TCTP直接參與了低劑量γ-輻照后的DNA損傷修復(fù)過程。利用多種特異的DNA損傷修復(fù)抑制劑復(fù)合10cGy輻照后發(fā)現(xiàn)，低劑量輻照時TCTP的核內(nèi)高表達(dá)屬于ATM和PI3K家族成員依賴性，而p53、HDM2非依賴性途徑調(diào)控；ATM-/-皮膚成纖維細(xì)胞中，TCTP對低劑量IR的反應(yīng)敏感性缺

12、失，進一步證實低劑量輻照后TCTP調(diào)控的ATM依賴性。
　　7.高劑量輻照所致的DNA損傷修復(fù)中，TCTP主要參與了p53下游的G1/S細(xì)胞檢測點調(diào)控。轉(zhuǎn)染TCTPsiRNA的細(xì)胞受到4Gy高劑量γ-輻照后，其p53表達(dá)以及DNA損傷修復(fù)趨勢同對照組無顯著差異；但是，其G1期阻滯時間較陽性對照組明顯縮短～5.5h，p21WAF1活化受阻。
　　結(jié)論：
　　1.人體細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性、生理性的DNA損傷修復(fù)體系，該體系也許

13、交叉但不能完全等同于強應(yīng)激病理狀態(tài)下的損傷修復(fù)體系，因此低劑量IR劑量-效應(yīng)關(guān)系不應(yīng)從高劑量反應(yīng)曲線任意外延；
　　2.正常人體皮膚細(xì)胞暴露于低劑量/高劑量IR后，TCTP的反應(yīng)敏感性及功能不同；
　　3.首次證實TCTP參與低劑量IR引起的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)及p53調(diào)控；
　　4.首次證實正常人體皮膚細(xì)胞受到高劑量IR輻照后，TCTP在G1/S細(xì)胞檢測點調(diào)控中發(fā)揮了重要作用；
　　5.TCTP可能成為理想的