分子氫在電離輻射防護(hù)作用中的機(jī)制研究.pdf

1、背景:2007年日本醫(yī)科大學(xué)Ohsawa等研究發(fā)現(xiàn)氫氣具有很強(qiáng)抗氧化性，這一發(fā)現(xiàn)，使氫氣迅速成為了學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)研究并報(bào)道了分子氫對多種器官和組織的多種疾病具有較好的防護(hù)和治療作用，對分子氫生物學(xué)作用的研究還在不斷深入。
　　本實(shí)驗(yàn)室在對分子氫生物學(xué)作用的研究中率先發(fā)現(xiàn)，分子氫對電離輻射損傷有著較好的防護(hù)作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了分子氫對受照細(xì)胞、造血組織、心血管組織、生殖系統(tǒng)及整體動(dòng)物等均有十分顯著的防護(hù)效果。

2、r>　　日本學(xué)者Ohsawa的研究中，證實(shí)了分子氫能夠選擇性清除·OH和ONOO-并認(rèn)為這是其發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制。然而，隨著對分子氫研究的不斷深入，愈來愈多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已無法用單純的選擇性清除自由基來解釋。多個(gè)研究提示，分子氫或許影響了機(jī)體某些信號傳導(dǎo)通路或是基因的表達(dá)。那么，在電離輻射損傷防護(hù)當(dāng)中，分子氫又是通過何種途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用呢？闡明分子氫發(fā)揮生物學(xué)活性的機(jī)制問題，將為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)，并促使其向臨床

3、應(yīng)用轉(zhuǎn)化。
　　因此，本研究主要圍繞著分子氫在電離輻射損傷防護(hù)中的分子機(jī)制而開展。本課題主要分為三個(gè)部分。第一部分研究分子氫在無細(xì)胞體系中中和多種自由基的能力。第二部分研究以機(jī)體內(nèi)重要抗氧化酶為研究對象，探討分子氫是否對其活性產(chǎn)生影響。第三部分探討Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用。
　　內(nèi)容:
　　1、分子氫對多種自由基的清除作用:通過不同的化學(xué)體系分別產(chǎn)生不同的自由基，使用電子自旋共振技術(shù)檢測加入

4、分子氫之后各種自由基含量的變化。
　　2、分子氫對機(jī)體重要抗氧化酶的影響:研究分子氫在無細(xì)胞體系中對抗氧化酶活性的影響;檢測分子氫對L-02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響。
　　3、Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用:建立分子氫細(xì)胞輻射防護(hù)模型，明確防護(hù)效果。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siNrf2，觀察干擾Nrf2后分子氫對電離輻射損傷的防護(hù)效果，對結(jié)果分析和討論。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、光照核黃素生成O-·2，使

5、用ESR檢測加入分子氫后其含量的變化;
　　2、使用ESR檢測加入分子氫后DPPH自由基含量的變化;
　　3、光照血卟啉產(chǎn)生單線態(tài)氧，利用ESR檢測加入分子氫后單線態(tài)氧含量的變化;
　　4、使用比色法檢測分子氫對多種抗氧化酶活性的影響;
　　5、L-02細(xì)胞給予4Gy和8Gy60Coγ射線照射，檢測給氫對照后細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞活力的影響，驗(yàn)證分子氫對L-02細(xì)胞的輻射防護(hù)作用;
　　6、使用Western

6、blot檢測分子氫對照后細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量的影響;
　　7、使用PCR檢測分子氫對照后細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)含量的影響;
　　8、利用lipo2000轉(zhuǎn)染siNrf2干擾L-02細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，在RNA及蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染效果;
　　9、干擾Nrf2后檢測酶活性，探討干擾Nrf2后分子氫對照后細(xì)胞抗氧化酶活性的影響;
　　10、干擾Nrf2，檢測照后L-02細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞活力，評價(jià)干擾后分子氫對

7、細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、在無細(xì)胞體系中產(chǎn)生多種自由基，使用ESR檢測，加氫組與對照組自由基含量無明顯差異，提示分子氫在無細(xì)胞體系中不能與其直接發(fā)生反應(yīng)，對其無明顯清除作用;
　　2、在純化的SOD及CAT溶液中直接通入氫氣，檢測分子氫對抗氧化酶的直接作用，結(jié)果提示，分子氫對酶活性沒有直接影響;
　　3、予以L-024Gyγ射線照射，照后24h，檢測各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抗氧化酶活性的影響。結(jié)果提

8、示:分子氫可以顯著提高照射后細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT及GSH-PX的活性;
　　4、予以L-024Gy和8Gyγ射線照射，照后24h，檢測細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞活力，結(jié)果為:細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力呈劑量依賴性變化，與照射組相比，加氫組能顯著降低照后細(xì)胞凋亡率及提高照后細(xì)胞活力，證明分子氫可以防護(hù)電離輻射對L-02細(xì)胞造成的損傷;
　　5、予以L-024Gyγ射線照射，照后4h提取細(xì)胞RNA，檢測Nrf2 mRNA的變化，結(jié)果為:各組之

9、間mRNA含量無明顯差異;
　　6、予以L-024Gy照射，照后6h提取總蛋白，檢測Nrf2蛋白水平的變化，結(jié)果為:給氫組Nrf2蛋白量明顯增加，提示分子氫可以激活Nrf2;
　　7、lipo2000轉(zhuǎn)染siNrf2，結(jié)果為:Nrf2mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯下調(diào)，轉(zhuǎn)染效果良好;
　　8、干擾Nrf2后，予以L-024Gy照射，照后24h檢測抗氧化酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗氧化酶的活性明顯下降;
　　9、干擾Nrf

10、2后，予以L-024Gy照射，照后24h檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力，結(jié)果為:分子氫對照后細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力無明顯影響，提示干擾后分子氫對輻射損傷的保護(hù)作用下降。
　　討論與分析:近年來，國內(nèi)外的眾多研究發(fā)現(xiàn)，分子氫對多種疾病具有十分顯著的防治作用。本實(shí)驗(yàn)室在對分子氫生物學(xué)效應(yīng)的研究中，率先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了分子氫對電離輻射損傷的防護(hù)作用。然而，目前對于分子氫的研究，大多數(shù)停留在效應(yīng)層面，有關(guān)分子氫作用機(jī)制的研究較少，對于分子氫的分子機(jī)制

11、仍不清楚。在前期對分子氫研究的基礎(chǔ)上，我們考慮通過以下方面來探討分子氫的作用機(jī)制:1、研究分子氫在無細(xì)胞體系中中和多種自由基的能力。2、以機(jī)體內(nèi)重要抗氧化酶為研究對象，檢測分子氫是否對其活性產(chǎn)生影響。3、探討Nrf2/ARE信號通路在分子氫輻射防護(hù)效應(yīng)中的作用。經(jīng)研究我們發(fā)現(xiàn)，在利用ESR對自由基含量的檢測中，并未觀察到加氫組自由基含量有明顯變化，提示在無細(xì)胞體系中分子氫對所研究的自由基并無明顯的清除作用。在對抗氧化酶的研究中，我們觀察

12、到分子氫與酶之間的直接相互作用并不能影響其活性，而分子氫可以顯著提高照后L-02細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。在此基礎(chǔ)上。我們對Nrf2信號通路進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分子氫可以明顯上調(diào)照后細(xì)胞Nrf2的蛋白水平。進(jìn)一步地，我們對Nrf2進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)，觀察到在干擾Nrf2之后，照后被分子氫上調(diào)的多種抗氧化酶不再升高，同時(shí)，分子氫對L-02的輻射防護(hù)效應(yīng)也顯著下降。這些結(jié)果提示，分子氫可能通過激活Nrf2/ARE信號通路發(fā)揮其防護(hù)輻射損傷的作用。