4E-BP1在電離輻射誘發(fā)DNA損傷應(yīng)激中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　研究探討真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1（eIF4E-binding protein1,4E-BP1)在電離輻射致細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中尤其是G2/M檢查點(diǎn)和紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點(diǎn)的功能調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
　　方法
　　肝癌 HepG2細(xì)胞模型，經(jīng)60Coγ射線照射誘發(fā)DNA損傷，Western blot檢測4E-BP1總蛋白和T37/46位點(diǎn)磷酸化蛋白的表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期阻滯情況；分子克隆法構(gòu)建敲低4E

2、-BP1表達(dá)的shRNA干擾質(zhì)粒，采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建4E-BP1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系；細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線；磷酸化組蛋白 H3/Ser10分子標(biāo)記物免疫標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來檢測M期細(xì)胞及G2/M檢查點(diǎn)功能；使用Nocodazole將對照細(xì)胞和4E-BP1敲低細(xì)胞同步化于有絲分裂的前中期，隨后去除Nocodazole，細(xì)胞進(jìn)入 G1期，來觀察敲低4E-BP1蛋白表達(dá)對紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點(diǎn)和細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的影響。
　

3、　結(jié)果
　　HepG2細(xì)胞在4Gy射線照射后4h、8h，4E-BP1的T37/46位點(diǎn)磷酸化水平升高，4E-BP1總蛋白表達(dá)含量基本不變，同時(shí)細(xì)胞周期監(jiān)測顯示4E-BP1磷酸化與細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯過程相關(guān)聯(lián)，高峰是發(fā)生在照射后10~14h。敲低4E-BP1后，細(xì)胞的生長速度變慢，對0.5Gy、1Gy較低劑量照射的敏感性增加；4Gy60Coγ射線照射后兩細(xì)胞系的G2/M檢查點(diǎn)均激活，但 G2期阻滯的解除時(shí)間存在差別，照射后12h

4、，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的HeLa-shvector細(xì)胞的M期細(xì)胞比例為2.24％而轉(zhuǎn)染敲低4E-BP1蛋白質(zhì)粒的HeLa-sh4E-BP1細(xì)胞的M期細(xì)胞已上升到4.26%。PI3K激酶抑制劑降低4E-BP1蛋白的穩(wěn)定性。
　　結(jié)論
　　4E-BP1的T37/46位點(diǎn)磷酸化蛋白在60Coγ射線的誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)，敲低4E-BP1蛋白后細(xì)胞生長活力下降,對1Gy及以下的低劑量照射的敏感性增加，不影響G2/M檢測點(diǎn)的激活，但4E-BP1蛋白