電離輻射小鼠皮膚傷口愈合延遲的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括凝血、炎癥，組織的增生，組織改建與重塑三個(gè)階段[1];而細(xì)胞因子在愈合的整個(gè)過程中均發(fā)揮著重要的作用，急性創(chuàng)傷時(shí)，細(xì)胞因子能夠發(fā)揮正常功能參與愈合過程，最終使皮膚屏障功能得到重建;而在慢性傷口中，炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤(rùn)導(dǎo)致傷口部位的蛋白水解環(huán)境改變，相關(guān)細(xì)胞因子被降解，使其未能發(fā)揮應(yīng)有的功能，從而抑制了正常傷口的愈合過程。全身電離輻射(ionizing radiation，IR)作

2、為一種特殊的損傷，其可以引起造血細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞數(shù)量的減少與功能的減退，影響并損害愈合過程中的諸多環(huán)節(jié)，從而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延緩。此外，當(dāng)IR損傷伴有燒傷、各種創(chuàng)傷等合并損傷時(shí)，導(dǎo)致最終形成電離輻射合并損傷（radiation combined injury, RCI）[2]。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)，該類傷口的愈合過程中可能存在細(xì)胞因子表達(dá)異常，而適量的、合理的運(yùn)用細(xì)胞因子可以促進(jìn)RCI的愈合，這不僅有利于組織的修復(fù)，而且可以提高傷口修復(fù)的質(zhì)量。目前，

3、盡管局部使用細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的方法有很多，但是在細(xì)胞因子的選擇及細(xì)胞因子的劑量上存在不同的觀點(diǎn)。此外，由于RCI屬于慢性損傷，在臨床治療中十分常見，如惡性腫瘤放療引起的皮膚潰瘍或放療后手術(shù)傷口，RCI存在傷口時(shí)，炎癥細(xì)胞的持續(xù)浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致傷口處形成蛋白水解酶的環(huán)境，外源性的細(xì)胞因子極易被降解，難以發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用。因此，選擇合適的細(xì)胞因子、劑量和外源性細(xì)胞因子體內(nèi)遞送方式，對(duì)促進(jìn)RCI傷口愈合有著十分重要的意義。
　　

4、細(xì)胞因子是能在細(xì)胞間傳遞信息并且具有明顯免疫調(diào)控和效應(yīng)功能的一類小分子生物活性多肽或糖蛋白[3]。細(xì)胞因子具有多效性、拮抗性、重疊性和協(xié)同性，它們相互作用調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)過程中的多種細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)合成、分泌都具有重要的調(diào)控作用。當(dāng)前研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF-A)、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(Platelet-derivedGrowth

5、Factor，PDGF-BB)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-a)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF)等均是創(chuàng)傷愈合過程中重要的細(xì)胞因子，在傷口愈合的不同時(shí)期有著不同的表達(dá)水平[4]，但是當(dāng)前對(duì)于這些細(xì)胞因子在RCI傷口中表達(dá)水平的研究較少;GM-CSF作為其中一個(gè)重要的細(xì)胞因子，

6、參與整個(gè)的創(chuàng)傷愈合過程，在創(chuàng)面愈合的炎癥階段它通過增加中性粒細(xì)胞的數(shù)量與功能而促進(jìn)創(chuàng)面的炎癥反應(yīng);在血管形成過程中能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移與增殖;還可以直接或通過IL-6間接作用角質(zhì)形成細(xì)胞，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進(jìn)再上皮化過程。在已有的糖尿病引發(fā)的慢性傷口治療研究中發(fā)現(xiàn)，局部GM-CSF治療可以有效促進(jìn)慢性傷口的愈合，認(rèn)為其可能成為將來治療慢性傷口的一種新的治療手段。目前缺乏GM-CSF治療RIC的研究報(bào)告。
　　 第一部分:電

7、離輻射損傷小鼠背部皮膚傷口愈合過程中多種細(xì)胞因子表達(dá)的觀察
　　 目的:通過檢測(cè)IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF的分子與蛋白水平的動(dòng)態(tài)表達(dá)，從而探討各種細(xì)胞因子對(duì)IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合的影響。
　　 方法:在6 Gy60Coγ全身電離輻射小鼠背部制作1.5×1.5cm的皮膚缺損，建立IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口模型，分別在致傷后的1d、3d、5d、7d取傷口皮

8、膚組織，通過Real time-PCR方法檢測(cè)VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)各種細(xì)胞因子蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:Real time-PCR結(jié)果顯示:比較IR損傷組與正常對(duì)照組傷口愈合過程中傷口局部組織中VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF四個(gè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，IR損傷組存在明顯的表達(dá)異常，在傷后不同時(shí)間點(diǎn)上PDGF-BB mR

9、NA的表達(dá)均低于對(duì)照組，第3天時(shí)兩組表達(dá)差異較大(P＜0.01)，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中存在PDGF-BB表達(dá)水平降低;在第3天時(shí)，IR損傷組VEGF-A mRNA的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，在第5天時(shí)對(duì)照組與IR損傷組均達(dá)到峰值，但I(xiàn)R損傷組表達(dá)低于于對(duì)照組，到第7天時(shí)對(duì)照組VEGF-A迅速下調(diào)，IR損傷組VEGF-A的表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.01)，提示提示IR會(huì)導(dǎo)致傷口組織VEGF-A mRNA表達(dá)

10、滯后;傷后7天中，IR損傷組TNF-a mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組，在第7天時(shí)，IR損傷組mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中存在TNF-a過表達(dá)介導(dǎo)的異常炎癥反應(yīng);在傷后第1、3、5天，IR損傷組GM-CSF mRNA的表達(dá)水均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，在傷后的第7天隨著對(duì)照組GM-CSF mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，二者之間無明顯差異，提示IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合的遲滯與I

11、R損傷造成傷口局部GM-CSF的低表達(dá)有關(guān)。同樣，免疫組化結(jié)果表明VEGF-A、PDGF-BB、TNF-a、GM-CSF蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)與mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)相吻合。
　　 結(jié)論:IR損傷可以造成皮膚缺損傷口局部多種細(xì)胞因子表達(dá)紊亂，其中包括生長(zhǎng)因子表達(dá)的延遲及降低，直接抑制肉芽組織增生、血管生成;炎癥細(xì)胞因子表達(dá)紊亂造成炎癥發(fā)育延遲，周期延長(zhǎng)。細(xì)胞因子表達(dá)紊亂既是IR的結(jié)果，也是導(dǎo)致RCI傷口愈合延遲的原因。
　　

12、第二部分:不同劑量rhGM-CSF殼聚糖-膠原蛋白水凝膠在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中的療效評(píng)價(jià)
　　 目的:探討不同劑量的rhGM-CSF（1500ng/ml，6000ng/ml及10000ng/ml）殼聚糖-膠原蛋白水凝膠對(duì)IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程中的影響作用，進(jìn)而尋找其最適的作用劑量。
　　 方法:我們?cè)诘谝徊糠值膶?shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上選擇rhGM-CSF作為體內(nèi)介入藥物，分別在IR損傷小鼠背部皮膚缺

13、損傷口使用不同劑量的rhGM-CSF(1500ng/ml、6000ng/ml和10000ng/ml)殼聚糖-膠原蛋白水凝膠，連續(xù)局部給藥5天，1次/天，以局部使用不含rhGM-CSF的殼聚糖-膠原蛋白水凝膠的為對(duì)照，然后進(jìn)行傷口愈合評(píng)價(jià)和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)。其中包括:①傷口愈合評(píng)價(jià):動(dòng)態(tài)描記實(shí)驗(yàn)治療組與對(duì)照組傷口殘余面積，運(yùn)用Image Pro plus v(1).5軟件系統(tǒng)對(duì)描記圖像進(jìn)行分析，測(cè)量傷口愈合過程中皮膚缺損區(qū)殘余面積比的

14、變化;用Masson染色法檢測(cè)傷后第14天皮膚傷口膠原纖維的含量;②相關(guān)內(nèi)源性細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè):皮膚傷口取材組，IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口局部使用rhGM-CSF(10000ng/ml)凝膠后，通過Realtime-PCR檢測(cè)創(chuàng)口組織PDGF-BB、VEGF-A、TNF-a的mRNA表達(dá)水平。分析不同劑量的GM-CSF在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口愈合過程的影響，進(jìn)而尋找其最適本研究模型條件下的治療劑量。
　　 結(jié)果:①在IR

15、損傷小鼠背部皮膚缺損傷口傷后第14天時(shí)，rhGM-CSF1500ng/ml、rhGM-CSF6000ng/ml不同劑量的實(shí)驗(yàn)治療組與空白對(duì)照組相比，小鼠背部殘余面積比均小于空白對(duì)照組(P＜0.01)，而rhGM-CSF10000ng/ml劑量的實(shí)驗(yàn)組的殘余面積比卻大于空白對(duì)照組(P＜0.05);結(jié)果還顯示在前7天6000ng/ml劑量rhGM-CSF凝膠治療組比1500ng/ml劑量rhGM-CSF凝膠治療組起效快;提示局部給予外源性的

16、rhGM-CSF凝膠可以明顯改善IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口的愈合過程，且在一定劑量范圍內(nèi)其濃度與治療功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組優(yōu)于rhGM-CSF1500ng/ml)，但當(dāng)rhGM-CSF劑量為10000ng/ml時(shí)，傷口愈合反而受到抑制;Masson染色法檢測(cè)傷后第14天皮膚傷口膠原纖維的含量結(jié)果:在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用不同劑量的rhGM-CSF(1500ng/ml、6000ng/ml和1000

17、0ng/ml)凝膠后，rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組明顯優(yōu)于其他三組，膠原著色深，面積分布較為廣泛，排列緊密。②相關(guān)內(nèi)源性細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果:在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用rhGM-CSF劑量為10000ng/ml時(shí)，1d、3d、5d、7d Realtime-PCR結(jié)果顯示VEGF-A、PDGF-BB細(xì)胞因子的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，提示在IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口使用劑量rhGM-CSF10000ng/ml的凝膠，會(huì)

18、不同程度抑制其他細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　 結(jié)論:細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)RCI傷口愈合的關(guān)鍵因素，外源性GM-CSF傷口局部運(yùn)用可以明顯影響RCI傷口愈合過程。本研究結(jié)果顯示:局部給予外源性的rhGM-CSF殼聚糖-膠原蛋白水凝膠可以明顯改善IR損傷小鼠背部皮膚缺損傷口的愈合過程，且在一定劑量范圍內(nèi)其濃度與治療功效成正比（rhGM-CSF6000ng/ml凝膠組優(yōu)于rhGM-CSF1500ng/ml凝膠組）。就促進(jìn)傷口愈合而言，外源性GM-