卵巢衰老相關(guān)基因的功能驗(yàn)證和機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的：
　　隨著卵巢的衰老,女性不僅喪失生育能力,更并發(fā)嚴(yán)重的圍絕經(jīng)期癥狀如潮熱、泌尿生殖道萎縮癥狀以及心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)等疾病和骨折的高發(fā)風(fēng)險(xiǎn),對女性身心健康造成重大危害。前期通過基因芯片篩選出一系列卵巢衰老關(guān)鍵基因,在基因和蛋白水平對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對相關(guān)基因作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　方法：
　　參考早期芯片結(jié)果以及文獻(xiàn)中衰老相關(guān)基因,通過實(shí)時定量PCR和Westernblo

2、t驗(yàn)證相關(guān)基因的表達(dá);通過小鼠卵巢囊內(nèi)siRNA注射,下調(diào)關(guān)鍵基因表達(dá),以及體外關(guān)鍵基因?qū)?yīng)單克隆抗體、重組蛋白調(diào)控關(guān)鍵基因?qū)?yīng)下游細(xì)胞信號通路;通過HE染色、TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)、westernblot、酶聯(lián)熒光分析(enzymelinkedfluoreseentassay,ELFA)、實(shí)時定量PCR、免疫熒光檢測關(guān)鍵基因?qū)π∈舐殉仓新雅萁M成、顆粒細(xì)胞凋亡、分化和激素分泌的影響,

3、以及卵巢關(guān)鍵功能基因及蛋白的表達(dá);運(yùn)用光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察關(guān)鍵基因?qū)β殉仓新雅萁M成、顆粒細(xì)胞凋亡以及功能蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)898a基因?qū)?yīng)mRNA和蛋白在小鼠卵巢中的表達(dá)隨小鼠周齡增加而降低;在促性腺激素預(yù)處理小鼠卵巢中,898a于PMSG(SerumGonadotrophin,孕馬血清)注射后4小時急劇降低,隨后逐漸升高,于HCG(humanchorionicgonadotrophin,人

4、絨毛膜促性腺激素)注射后短暫下降,隨后與排卵前后升高。
　　(2)體內(nèi)下調(diào)卵巢局部898a表達(dá),導(dǎo)致卵巢中閉鎖卵泡的數(shù)量增加,顆粒細(xì)胞凋亡顯著,始基卵泡數(shù)量減少。抑制卵母細(xì)胞功能基因GDF9、BMP15、ZP3和卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞連接蛋白Connexin37表達(dá),而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖核抗原、顆粒細(xì)胞連接蛋白Connexin43以及甾體激素合成相關(guān)酶表達(dá),降低顆粒細(xì)胞AMH的表達(dá)和分泌。
　　(3)898a抑制體外顆粒細(xì)胞雌孕激

5、素合成,尤其抑制孕激素合成相關(guān)酶表達(dá),并促進(jìn)顆粒細(xì)胞AMH的表達(dá)。
　　(4)PRXs在小鼠卵巢中隨卵巢功能的降低而顯著降低。PRDXⅠ在PMSG注射后表達(dá)逐漸升高,而于HCG注射后表達(dá)降低,并于排卵和黃體形成早期表達(dá)升高,在性成熟小鼠各動情周期卵巢中表達(dá)無顯著差異;PRDXⅢ在PMSG&HCG序貫注射后表達(dá)逐步降低,于排卵前最低,而排卵后黃體形成早期則逐漸升高至對照組水平,在性成熟小鼠各動情周期卵巢中表達(dá)無顯著差異;PRDXⅣ在

6、PMSG注射后表達(dá)升高,而在排卵及黃體形成早期表達(dá)降低,在性成熟小鼠各動情周期卵巢中表達(dá)無顯著差異;PRDXⅤ在PMSG注射后和黃體形成早期表達(dá)顯著升高,而在排卵前表達(dá)降低,在性成熟小鼠動情期和動情后期表達(dá)顯著高于動情前期和動情間期;PRDXⅥ在PMSG注射和黃體形成早期表達(dá)升高,而在排卵前后表達(dá)降低,在性成熟小鼠動情前期表達(dá)高于動情后期和動情間期。
　　(5)NRP1表達(dá)隨小鼠卵巢功能的降低而顯著降低,在小鼠始基卵泡形成期表達(dá)高

7、于初級卵泡和次級卵泡形成期,在未成熟小鼠PMSG注射后中表達(dá)先降低后于PMSG注射48小時時表達(dá)升高,至排卵前后卵巢中表達(dá)進(jìn)一步升高,而黃體早期降低。
　　結(jié)論：
　　(1)898a是小鼠卵巢衰老相關(guān)基因,在卵泡發(fā)育的發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　(2)898a基因的缺失導(dǎo)致卵泡閉鎖增加,卵巢中AMH水平降低,始基卵泡消耗加速。
　　(3)898a抑制顆粒細(xì)胞過度增殖和終末分化,從而維持顆粒細(xì)胞AMH分泌。