青蒿琥酯對CLP免疫抑制模型小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：膿毒癥（sepsis）是因感染或感染因素而導(dǎo)致的宿主反應(yīng)失調(diào)所引起的危及生命的器官功能障礙綜合征。膿毒癥是涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損害等一系列臨床問題的綜合癥，盡管如今醫(yī)療技術(shù)逐步提升，該癥死亡率仍居高不下。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年受膿毒癥影響的患者達(dá)到3150萬，而嚴(yán)重膿毒癥病例1940萬，約造成全球每年530萬人死亡，是臨床急危重癥患者死亡的主要原因。
　　膿毒癥的病理生理過程首先是感染或感染因素引發(fā)機(jī)體的免疫失調(diào)

2、，以過度炎癥反應(yīng)為初始免疫反應(yīng)，即進(jìn)入炎癥風(fēng)暴（cytokine storm）即全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）階段；因持續(xù)的免疫失調(diào)，機(jī)體隨即進(jìn)入膿毒癥免疫抑制階段，患者會因繼發(fā)感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)，這與膿毒癥患者后期的免疫抑制、機(jī)體對致病菌的二次打擊(second hit)抵抗力減弱密切相關(guān)。因此，膿毒癥患者死亡高峰期有兩個，一個是炎癥風(fēng)暴期，大約30％的患者于該階段死亡；另一個即免疫抑制期，大約70%的患者會因繼發(fā)

3、感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)于該階段死亡。
　　關(guān)于膿毒癥免疫抑制發(fā)生的時間點(diǎn)及其病理生理特點(diǎn)，目前學(xué)術(shù)界存在兩種不同的觀點(diǎn)：一種認(rèn)為膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的本質(zhì)是代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)，是隨著SIRS出現(xiàn)而出現(xiàn)，該階段的特點(diǎn)是抗炎細(xì)胞因子水平顯著降低，而抗炎細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β及IL-4等過度產(chǎn)生；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為免疫抑制狀態(tài)是在機(jī)體完全度過炎癥風(fēng)暴后出現(xiàn)，其特點(diǎn)是致炎和抗炎細(xì)胞因子整體水平的降低。<

4、br>　　由于針對 SIRS開展的膿毒癥免疫治療藥物研究并沒有達(dá)到降低患者死亡率的目標(biāo)。目前，研究者們致力于以改善免疫抑制狀態(tài)為目的的免疫調(diào)節(jié)藥物的研究，希望治療膿毒癥的藥物應(yīng)同時具有抗炎和逆轉(zhuǎn)免疫抑制的雙向調(diào)節(jié)作用。
　　膿毒癥免疫抑制病理生理機(jī)制和治療藥物進(jìn)行研究的基礎(chǔ)是有一個可反映臨床膿毒癥免疫抑制病理生理特征的動物模型。目前學(xué)術(shù)界認(rèn)可的膿毒癥免疫抑制模型主要包括：內(nèi)毒素耐受模型和盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)。本課題組前期已經(jīng)成

5、功建立小鼠內(nèi)毒素耐受模型，但鑒于該模型尚不能完全反映臨床膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的病理生理特征，為此在本研究中首先著力于CLP膿毒癥免疫抑制模型的建立。
　　CLP膿毒癥模型目前被認(rèn)為是進(jìn)行膿毒癥研究動物模型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，更接近于臨床實(shí)際。但國內(nèi)外關(guān)于CLP膿毒癥免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)的報道各不相同，按照文獻(xiàn)進(jìn)行免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)的研究未獲成功。因此，本研究首先基于CLP膿毒癥模型進(jìn)行膿毒癥免疫抑制模型的建立，然后將銅綠假單胞菌（PA）作為二次打擊

6、病原體建立CLP膿毒癥免疫抑制二次打擊模型，對膿毒癥免疫抑制模型進(jìn)行系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步研究膿毒癥免疫抑制的病理生理過程、評價治療膿毒癥的藥物尤其是治療膿毒癥免疫抑制的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　抗瘧藥青蒿琥酯(AS)是含有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素衍生物，該藥廣泛應(yīng)用于瘧疾的治療，長期的臨床應(yīng)用已顯示其具有毒性低、安全性好的特點(diǎn)。課題組在前期中發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對CLP及不同細(xì)菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等）造成的膿毒癥模型

7、小鼠均顯示出顯著的治療作用；對LPS耐受模型的膿毒癥免疫抑制小鼠模型也具有顯著療效，能提高LPS耐受小鼠受二次打擊的生存率，升高體內(nèi)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的釋放并增強(qiáng)免疫抑制小鼠細(xì)菌清除能力。
　　因此，本課題擬在建立CLP膿毒癥免疫抑制動物模型的基礎(chǔ)上，觀察青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠的治療作用；并在建立內(nèi)毒素耐受細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，觀察青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠治療作用的可能機(jī)制，為尋找有效治療膿毒癥的藥物并拓寬

8、青蒿琥酯的臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、CLP膿毒癥免疫抑制小鼠模型的建立與評價
　　1.小鼠CLP模型術(shù)式的選擇：通過觀察小鼠的7天死亡率，篩選出可導(dǎo)致40%CLP小鼠死亡的術(shù)式。
　　2. CLP膿毒癥免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)的確定：復(fù)制40%死亡率的CLP模型小鼠，并于術(shù)后不同時相點(diǎn)（0.5、1、2、3、4、5、6、7天），尾靜脈注射PA（2.5×107 CFU/10g），通過觀察小鼠的7天死亡率確定

9、膿毒癥免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)，完成CLP膿毒癥免疫抑制小鼠模型的建立。
　　3. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠對不同劑量細(xì)菌的敏感性觀察：在 CLP組及假手術(shù)（Sham）組小鼠術(shù)后1天（24 h），給予尾靜脈注射7個劑量的銅綠假單胞菌（PA,2.5×108、5×107、2.5×107、5×106、1×106、5×105、1×104 CFU/10g，給菌體積為0.1 mL/10 g體重），觀察和記錄小鼠7天死亡率。
　　4. CLP膿毒癥

10、免疫抑制小鼠炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的檢測：ELISA法檢測各組（NS組、Sham組、CLP組、Sham+PA組、CLP+PA組）血清、脾臟及肺臟中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子濃度。
　　5. CLP術(shù)后小鼠炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平動態(tài)變化情況的檢測：ELISA法檢測CLP術(shù)后各組時相點(diǎn)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的變化情況：Sham組術(shù)后（0、2、8、12、24 h）， CLP組術(shù)后(0、2、4、8、12、24、48、72 h)，Sham+PA組(給菌后4、2

11、4、48 h)， CLP+PA組給菌后(4、24 h)。
　　6. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠靜脈血細(xì)胞數(shù)量的檢測：小鼠CLP術(shù)后1天（24 h）尾靜脈注射PA，并于4 h后經(jīng)眼底靜脈叢取血、抗凝管收集后立即通過小動物血液分析儀對各組小鼠靜脈血五種白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞）的絕對值及百分比進(jìn)行檢測。
　　7. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠細(xì)菌清除能力的觀察：小鼠CLP術(shù)后1天（24 h）尾

12、靜脈注射PA，并于4 h后取材，采用平板計數(shù)法觀察小鼠（NS組、Sham組、CLP組、Sham+PA組、CLP+PA組）血液、脾臟及肺臟中細(xì)菌量確定各組小鼠對細(xì)菌清除能力。
　　二、青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠的治療作用
　　1.觀察青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后7天死亡率的影響。
　　2.觀察青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠及CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后細(xì)胞

13、因子的影響：采用 ELISA法檢測青蒿琥酯對小鼠體內(nèi)致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β及抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-β水平的影響
　　3.青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠及CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受 PA二次打擊后血細(xì)胞的影響：通過小動物血液分析儀，對小鼠靜脈血中白細(xì)胞及五種亞型（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞）的絕對值及百分比進(jìn)行檢測。
　　4.青蒿琥酯CLP

14、膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后細(xì)菌清除能力的觀察：采用平板計數(shù)法觀察青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠接受PA二次打擊后血液、肺臟和脾臟中細(xì)菌數(shù)量變化的影響。
　　三、青蒿琥酯對膿毒癥免疫抑制模型小鼠治療作用分子機(jī)制的初步研究
　　1.體外實(shí)驗(yàn)
　?。?）免疫抑制細(xì)胞模型的建立與評價：建立內(nèi)毒素/脂多糖（LPS）耐受細(xì)胞模型（RAW264.7細(xì)胞），并將該細(xì)胞模型作為膿毒癥免疫抑制的體外模型開展研究；根據(jù)

15、LPS與TNF-α釋放的量效、時效關(guān)系的結(jié)果確定LPS耐受細(xì)胞模型刺激用LPS濃度及取材時間；ELISA法檢測細(xì)胞TNF-α的釋放水平、WB法檢測細(xì)胞總蛋白中炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)情況，以此評價細(xì)胞模型。
　　（2）青蒿琥酯對LPS耐受細(xì)胞釋放TNF-α的影響：ELISA法檢測LPS耐受細(xì)胞及青蒿琥酯給藥組細(xì)胞TNF-α的釋放水平。
　?。?）青蒿琥酯對 LPS耐受細(xì)胞炎癥及自噬相關(guān)關(guān)鍵分子的影響：W

16、B法檢測細(xì)胞總蛋白中TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要分子及自噬相關(guān)關(guān)鍵分子TLR4、BECN1的表達(dá)情況。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制小鼠及CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后體內(nèi)TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要分子及自噬相關(guān)關(guān)鍵分子的影響：采用免疫組織化學(xué)技術(shù)和WB兩種方法法檢測小鼠肺臟和脾臟中中重要分子及自噬相關(guān)關(guān)鍵分子TLR4、MyD88、TRAF6、BECN1蛋白表達(dá)及NF-κBp65的活化情況。

17、>　　結(jié)果：
　　一、CLP膿毒癥免疫抑制小鼠模型的建立與評價
　　1.小鼠 CLP模型的術(shù)式選擇：小鼠死亡率因不同的結(jié)扎距離、不同直徑穿刺針及不同數(shù)目腸穿孔而不同，成功建立了7天內(nèi)動物死亡率分別為0、10.0%、36.3%、45.4%的四種CLP模型。選擇了45.4%死亡率的CLP4組作為膿毒癥模型術(shù)式（距離盲腸盲端1.0 cm處結(jié)扎，16號鋼針穿刺1孔）
　　2. CLP膿毒癥免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)的確定：CLP手術(shù)后1天

18、（24 h）給予PA的小鼠7天死亡率顯著高于CLP組；而CLP2天至7天給予PA均未顯示出二者顯著差異。因此，CLP膿毒癥免疫抑制小鼠免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)初步可能為 CLP手術(shù)后1天（24 h）。
　　3.不同劑量細(xì)菌對CLP術(shù)后1天小鼠造成不同的死亡率：CLP術(shù)后1天（24 h）小鼠與 Sham組小鼠比較，其對不同劑量的細(xì)菌攻擊敏感性更高，初步認(rèn)為該時相點(diǎn)為免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)。
　　4. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠受到PA攻擊后，體內(nèi)

19、的致炎細(xì)胞因子水平(血清、脾臟及肺臟中TNF-α、IL-6和IL-1β)及抗炎細(xì)胞因子水平（肺臟IL-4、IL-10、TGF-β）均未顯著升高，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子釋放情況呈全面抑制狀態(tài)，符合膿毒癥免疫抑制的病理生理特點(diǎn)。
　　5. CLP術(shù)后炎癥相關(guān)細(xì)胞因子動態(tài)變化情況的檢測：致炎細(xì)胞因子及抗炎細(xì)胞因子均呈現(xiàn)了先升高后降低的趨勢；給菌后4h的致炎細(xì)胞因子及抗炎細(xì)胞因子結(jié)果均再次顯示CLP+PA組的水平明顯比Sham+PA組低。

20、>　　6. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠靜脈血細(xì)胞中白細(xì)胞數(shù)量顯著降低，其白細(xì)胞五種分型百分比也有明顯變化。
　　7. CLP膿毒癥免疫抑制小鼠細(xì)菌清除能力的觀察：平板計數(shù)結(jié)果顯示NS組、Sham組、CLP組血液、脾臟和肺臟中均無PA菌落檢出；而Sham+PA組血液、脾臟和肺臟中PA菌落均顯著少于CLP+PA組，顯示Sham組對細(xì)菌清除能力顯著強(qiáng)于CLP術(shù)后1天（24 h），再次顯示CLP術(shù)后1天（24 h）小鼠處于免疫抑制狀態(tài)。

21、r>　　二、青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠的治療作用
　　1.青蒿琥酯能顯著降低CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后的7天死亡率。
　　2.青蒿琥酯能顯著增加CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠及接受PA二次打擊后血清、脾臟和肺臟致炎細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β水平；降低肺臟中抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-β水平。
　　3.青蒿琥酯對CLP膿毒癥免疫抑制小鼠及CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)

22、小鼠接受PA二次打擊后靜脈血中白細(xì)胞絕對值及五種分型的絕對值及百分比的影響較小。
　　4.青蒿琥酯能顯著減少CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后血液、肺臟和脾臟中細(xì)菌數(shù)量。
　　三、青蒿琥酯對膿毒癥免疫抑制模型的治療作用機(jī)制的初步研究
　　1.體外實(shí)驗(yàn)
　　（1）采用將0.01 ng/mL LPS預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞4 h的方法建立LPS耐受細(xì)胞模型，再給予10 ng/mL LPS處理該細(xì)胞，結(jié)果

23、顯示細(xì)胞釋放TNF-α的水平并無顯著上升，表明采用該方法可建立體外LPS耐受模型；WB結(jié)果提示，該模型細(xì)胞TLR4、MyD88表達(dá)水平較低，進(jìn)一步表明該方法可成功建立體外LPS耐受細(xì)胞模型。
　　（2）青蒿琥酯（20μg/mL）可顯著提高LPS耐受細(xì)胞模型釋放TNF-α的能力。
　　（3）WB結(jié)果提示，在LPS耐受細(xì)胞模型中，青蒿琥酯（20μg/mL）可增加該模型細(xì)胞TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要分子TLR4及自噬相關(guān)關(guān)鍵分子B

24、ECN1的表達(dá)。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　（1）在CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠及CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊模型中，免疫組織化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青蒿琥酯（10 mg/kg）能增加免疫抑制模型小鼠肺臟和脾臟中TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及自噬相關(guān)重要分子TLR4、TRAF6、BECN1蛋白表達(dá)及NF-κBp65蛋白亞基的活化水平。
　?。?）WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯（10 mg/kg）能增加CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠

25、肺臟中TLR4、MyD88、TRAF6、LC3蛋白的表達(dá)，增加NF-κBp65亞基的活化水平；青蒿琥酯能增加CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后肺臟中TLR4、MyD88、BECN1蛋白的表達(dá)，增加NF-κBp65蛋白亞基的活化水平。
　　結(jié)論：
　　1.建立約40%死亡率的CLP膿毒癥模型，CLP術(shù)后24 h時相點(diǎn)為膿毒癥免疫抑制轉(zhuǎn)折點(diǎn)；該模型穩(wěn)定性好、重復(fù)性高，且造模周期短；
　　2.青蒿琥酯可顯著增加C

26、LP膿毒癥免疫抑制模型小鼠致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 IL-1β及抗炎細(xì)胞因子IL-10、IL-4、TGF-β的釋放水平；
　　3.青蒿琥酯可顯著降低CLP膿毒癥免疫抑制狀態(tài)小鼠接受PA二次打擊后的7天死亡率，表明其對膿毒癥免疫抑制小鼠模型具有很好的治療作用，并顯著提高CLP膿毒癥免疫抑制模型小鼠對銅綠假單胞菌的清除能力；
　　4.青蒿琥酯對膿毒癥免疫抑制小鼠的治療作用機(jī)制可能與其增加 LR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及自噬相關(guān)關(guān)鍵