青蒿琥酯抗小鼠中暑內(nèi)毒素血癥及其信號轉(zhuǎn)導機制的研究.pdf

1、研究背景：內(nèi)毒素血癥是中暑重要的病理生理過程，其防治一直是研究的熱點內(nèi)容。近年來，隨著對內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導通路研究的不斷深入和清晰，內(nèi)毒素血癥的治療手段正逐漸轉(zhuǎn)到影響其信號轉(zhuǎn)導通路中關鍵受體分子表達的方向上來。青蒿琥酯是近來發(fā)現(xiàn)有良好的抗外源性內(nèi)毒素血癥效果的藥物，但它在中暑領域的應用國內(nèi)外尚屬空白，因此，探討青蒿琥酯對內(nèi)源性中暑內(nèi)毒素血癥的作用以及對內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導通路的影響，能清楚的了解藥物的作用機制，更好的為該類藥物在中暑內(nèi)毒素血癥的防

2、治應用中奠定基礎。 目的：探討青蒿琥酯對中暑內(nèi)毒素血癥的作用及其可能的信號轉(zhuǎn)導機制，為其在防治中暑內(nèi)毒素血癥中的應用奠定理論基礎。 方法：實驗分為兩個部分。第一部分：青蒿琥酯在中暑內(nèi)毒素血癥小鼠中的作用。昆明小鼠隨機分為高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯組(按小鼠體重腹腔注射給藥)，其中青蒿琥酯組又按不同的給藥方式和給藥濃度分為三組，分別為一次性給藥80mg/kg組和連續(xù)5天給藥的40mg/kg組與60mg/kg組，生理鹽水組

3、按對照的藥物組濃度給藥。最后一次給藥后，各組均在人工熱氣候模擬艙內(nèi)熱暴露，保持干球溫度(Tdb)(35±0.5)℃和相對濕度(RH)(65±5)％的條件，每30min測量肛溫一次，觀察各組小鼠的存活時間。同時取高溫2h組、生理鹽水60mg/kg2h組和青蒿琥酯60mg/kg2h組的肝組織標本，透射電鏡觀察肝組織的病理變化。第二部分：青蒿琥酯抗中暑內(nèi)毒素血癥信號轉(zhuǎn)導機制的研究。此部分亦分為兩個實驗：1.青蒿琥酯對內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導通路中CD1

4、4和TLR4mRNA表達的影響。昆明小鼠隨機分為常溫組、高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯60mg/kg組(按小鼠體重連續(xù)5天腹腔注射給藥)，之后常溫組在Tdb(25±0.5)℃、RH(43±5)％條件下暴露2h；其它組的熱暴露氣象條件同第一部分，誘導小鼠產(chǎn)生中暑內(nèi)毒素血癥，均分1、2h兩個觀察時段，到觀察時間采血，分離腹腔巨噬細胞，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血漿中腫瘤壞死因子a(TNF-a)的分泌量，用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

5、檢測腹腔巨噬細胞內(nèi)CD14和TLR4mRNA的表達水平。2.青蒿琥酯對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。昆明小鼠隨機分為常溫組、高溫組和青蒿琥酯60mg/kg組(方法同前)，常溫組在Tdb(25±0.5)℃、RH(43±5)％條件下暴露2h，另外兩組在與第一部分相同的氣象條件下暴露2h，之后立即分離腹腔巨噬細胞，采用Fluo-3/AM負載及流式細胞儀檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。 結果：第一部分：青蒿琥酯在中暑內(nèi)

6、毒素血癥小鼠中的作用。一次性給藥實驗結果顯示，高溫組、生理鹽水組和青蒿琥酯80mg/kg組小鼠的平均存活時間分別為(91.7±11.9)min、(96.9±12.5)min和(102.9±15.3)min，肛溫上升速率分別為(0.057±0.009)℃/min、(0.056±0.007)℃/min和(0.047±0.008)℃/min;生理鹽水組小鼠雖在存活時間和肛溫上升速率上較高溫組稍好，但二組間無統(tǒng)計學差異；一次性給予青蒿琥酯80m

7、g/kg組與高溫組比較，小鼠的存活時間明顯延長(P＜0.05)，肛溫上升速率也顯著降低(P＜0.01)；藥物組雖與生理鹽水組在存活時間上無統(tǒng)計學差異，但肛溫上升速率比較P＜0.05，說明青蒿琥酯對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠確有保護作用。連續(xù)5天給藥對小鼠的保護作用就更加明顯，青蒿琥酯40mg/kg組和60mg/kg組小鼠的平均存活時間分別為(111.1±12.8)min和(126.7±17.9)min，與高溫組(93.8±12.5)min和生理

8、鹽水組(96.5±15.3)min相比，藥物組小鼠的存活時間均明顯延長，以青蒿琥酯60mg/kg組為著，且均P＜0.01；在肛溫上升速率上，高溫組和生理鹽水組分別為(0.055±0.008)℃/min和(0.052±0.005)℃/min，青蒿琥酯40mg/kg組和60mg/kg組則分別為(0.043±0.004)℃/min和(0.039±0.005)℃/min，兩個藥物組的肛溫上升速率明顯降低，青蒿琥酯40mg/kg組與兩個對照組比較

9、均P＜0.05，60mg/kg組則均P＜0.01，這進一步證實了青蒿琥酯對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠的保護作用；生理鹽水組與高溫組間亦無統(tǒng)計學差異，說明生理鹽水對中暑小鼠的保護作用不理想。單獨將三個藥物組比較發(fā)現(xiàn)，無論是存活時間還是肛溫上升速率，連續(xù)5天給藥效果均好于一次性給藥效果；在連續(xù)5天給藥中，青蒿琥酯60mg/kg濃度效果又優(yōu)于40mg/kg濃度。同時，肝組織電鏡照片觀察到，高溫2h組和生理鹽水2h組肝細胞核均有皺縮，核內(nèi)染色體聚集成塊

10、狀，核膜不整，胞漿基質(zhì)密度低，線粒體腫脹、變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解；而青蒿琥酯60mg/kg2h組的肝細胞無明顯異常，核膜完整，染色體分布均勻，細胞器數(shù)量未見明顯減少，僅內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度擴張，線粒體有部分腫脹，進一步說明了青蒿琥酯對細胞的保護作用。 第二部分：青蒿琥酯抗中暑內(nèi)毒素血癥信號轉(zhuǎn)導機制的研究。1.青蒿琥酯對內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導通路中CD14和TLR4mRNA表達的影響。與常溫組的水平相比，高溫組1、2h的CD1

11、4和TLR4mRNA表達水平均顯著升高(P＜0.01)，并呈現(xiàn)出隨時間升高的趨勢。生理鹽水組1h的CD14和TLR4mRNA表達亦顯著升高(P＜0.01)，但在2h時均有輕度下降，呈現(xiàn)出隨時間下降的趨勢，CD14在2h的表達量與同組1h水平相比P＜0.05，與高溫組2h水平相比P＜0.01，而TLR4在2h的表達量與同組1h水平間無顯著性差異，但與高溫組2h水平相比P＜0.01。青蒿琥酯60mg/kg組1、2h的CD14和TLR4mRN

12、A表達均明顯降低，低于常溫組的水平，并呈現(xiàn)出隨時間輕微下降的趨勢，與常溫組比較無統(tǒng)計學差異，但與高溫組和生理鹽水組的同時段比較均P＜0.01，表明青蒿琥酯能夠明顯降低內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導通路中CD14和TLR4兩個關鍵受體分子的表達。同時，各組血漿中TNF-a的分泌量呈現(xiàn)出與兩個分子同樣的變化趨勢。高溫組兩個時段的TNF-a分泌量是顯著增加的，與常溫組比較均P＜0.01；生理鹽水組亦是在1h時TNF-a顯著升高而2h時輕度降低，均與常溫組比較

13、P＜0.01，但生理鹽水2h水平與高溫組2h的TNF-a的分泌量比較P＜0.01。青蒿琥酯組1、2h的TNF-a分泌量有輕度升高，同組內(nèi)及與常溫組間比較均無統(tǒng)計學差異，但與其他組同時段比較均P＜0.01，表明青蒿琥酯能減少血漿中TNF-a的分泌量。2.青蒿琥酯對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠腹腔巨噬細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響。常溫組、高溫組和青蒿琥酯60mg/kg組的細胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度分別為(3.30±0.67)、(14.26±1.79)和(

14、5.28±0.49)，與常溫組比較，高溫組細胞內(nèi)游離鈣離子濃度顯著升高(P＜0.01)，藥物組細胞內(nèi)游離鈣離子濃度僅有輕度升高，與常溫組比較P＜0.05，與高溫組比較P＜0.01，表明在中暑內(nèi)毒素血癥時細胞內(nèi)游離鈣離子濃度是明顯升高的，青蒿琥酯則能抑制細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的大幅上升。 結論：1.首次證實青蒿琥酯具有對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠良好的保護作用，它能延長小鼠的存活時間，降低其肛溫上升速率；有利于保持小鼠細胞內(nèi)部正常結構、維持

15、細胞器的數(shù)量和功能。 2.青蒿琥酯的不同給藥方式和給藥濃度對中暑內(nèi)毒素血癥小鼠的保護作用存在差異，連續(xù)5天給藥效果優(yōu)于一次性大劑量給藥效果，而連續(xù)5天給予青蒿琥酯60mg/kg效果最佳。 3.中暑內(nèi)毒素血癥時，LPS信號轉(zhuǎn)導通路上CD14和TLR4分子的表達顯著增加，細胞內(nèi)游離鈣離子濃度亦明顯升高，導致血漿中TNF-a含量增加；青蒿琥酯則能明顯下調(diào)CD14和TLR4的表達，降低細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，減少TNF-a的分泌。

16、 4.在LPS信號轉(zhuǎn)導通路中，TLR4是CD14下游的關鍵跨膜分子，兩者在中暑內(nèi)毒素血癥時的表達變化趨勢的一致性說明：在LPS信號轉(zhuǎn)導通路中，某個上游分子的表達變化會使與其相聯(lián)系的、發(fā)揮同樣作用的下游分子亦發(fā)生相同的變化，以利于提高信號轉(zhuǎn)導的協(xié)調(diào)性和高效性，擴大LPS的生物學效應。5.細胞內(nèi)游離鈣離子濃度和血漿中TNF-a含量的變化與CD14和TLR4的變化趨勢相同，說明整個LPS信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)是協(xié)調(diào)的。 6.青蒿琥