青蒿琥酯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除內(nèi)毒素、大腸埃希菌的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷、感染、休克和大手術(shù)等后常見(jiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官系統(tǒng)功能障礙綜合征(multiple organ dysfuctionsyndrome，MODS)，是臨床危重患者的主要死亡原因之一，病死率高達(dá)50%-80%，目前尚無(wú)有效的治療手段。脂多糖/內(nèi)毒素(lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要成分，是導(dǎo)致膿毒癥(sepsis)的主要致

2、病因子。LPS可通過(guò)與TOLL樣受體4(Toll-like receptors4，TLR4)、清道夫受體(scavenger receptor，SR)等模式識(shí)別受體結(jié)合后內(nèi)化入胞實(shí)現(xiàn)LPS的降解清除，并激活單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)NF-κB、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的的活化，引起過(guò)度的炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生。單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)可識(shí)別、內(nèi)化LPS，也可直接吞噬、消化細(xì)菌。
　　 尋找拮抗LPS的藥物是世界各國(guó)科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。

3、青蒿琥酯(artesunate，AS)為青蒿素的水溶性衍生物，在抗瘧、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等方面有廣泛應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可通過(guò)降低血清LPS水平保護(hù)膿毒癥模型小鼠，并可明顯降低熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠死亡率，但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯并不能直接結(jié)合、中和LPS。因此，我們推測(cè)青蒿琥酯保護(hù)膿毒癥模型小鼠、降低血清LPS水平的機(jī)制可能與其增加單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的內(nèi)化清除能力有關(guān)。
　　 目的
　　 以小鼠

4、腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探討青蒿琥酯對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除LPS、大腸埃希菌能力的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法
　　 1.青蒿琥酯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除內(nèi)毒素、大腸埃希菌的的作用研究
　　 (1)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　 (2)應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察青蒿琥酯、網(wǎng)格蛋白抑制劑MDC、內(nèi)體酸化抑制劑氯喹對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化FITC-LPS的影響。
　　 (3)應(yīng)用激光

5、共聚焦顯微鏡和菌落集落形成記數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察青蒿琥酯對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除大腸埃希菌的影響。
　　 2.青蒿琥酯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除內(nèi)毒素、大腸埃希菌的作用機(jī)制研究
　　 (1)應(yīng)用ELISA法觀察青蒿琥酯、MDC、氯喹處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6釋放的影響。
　　 (2)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)青蒿琥酯、LPS處理前后、TLR4、SRs mRNA以及AOAH m

6、RNA表達(dá)的變化。
　　 (3)應(yīng)用FAM技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞膜上TLR4、SRs受體表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.青蒿琥酯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除內(nèi)毒素、大腸埃希菌的的作用研究
　　 (1)成功分離了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，且細(xì)胞純度、活力符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　 (2)青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)LPS的內(nèi)化，且在MDC、氯喹存在的情況下仍可增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

7、對(duì)LPS的內(nèi)化。
　　 (3)青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)大腸埃希菌的內(nèi)化與清除。
　　 2.青蒿琥酯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化清除內(nèi)毒素、大腸埃希菌的作用機(jī)制研究
　　 (1)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別經(jīng)青蒿琥酯、MDC、氯喹處理后，LPS刺激所致的TNF-α、IL-6釋放被顯著抑制；且青蒿琥酯與MDC、氯喹共同作用可進(jìn)一步增強(qiáng)這種抑制作用。
　　 (2)青蒿琥酯對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4、SR-A、MA

8、RCO、SR-BⅠ及AOAH mRNA的表達(dá)均有影響。
　　 (3)青蒿琥酯不影響小鼠腹腔巨噬細(xì)胞胞膜上TLR4、SRs的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.青蒿琥酯能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化LPS的能力，且在網(wǎng)格蛋白抑制劑、內(nèi)體酸化抑制劑存在的情況下仍可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)化LPS的能力。
　　 2.青蒿琥酯能夠增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)大腸埃希菌的內(nèi)化與清除。
　　 3.青蒿琥酯增加小鼠腹腔巨噬細(xì)胞