內(nèi)毒素血癥小鼠骨骼的變化及機制的初步研究.pdf

1、目前在危重病方面，組織、器官損害機制和防治方法的研究主要集中在心血管、肺、腎臟、血液、免疫系統(tǒng)、干細(xì)胞，對感染、休克及膿毒癥等危重病情況下骨骼的相關(guān)變化及作用機制研究很少。近年來發(fā)現(xiàn)，骨細(xì)胞是內(nèi)分泌細(xì)胞，其分泌的基質(zhì)蛋白一骨鈣素可下調(diào)血糖。更重要的是，骨骼內(nèi)的骨髓是體內(nèi)多種造血干細(xì)胞及免疫細(xì)胞等的重要來源，骨細(xì)胞與免疫、干細(xì)胞間存在復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)，在干細(xì)胞分化、動員入血中有重要作用，提示骨骼在全身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。事實上，近年

2、來已發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激情況下，全身改變特別是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化可影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能。內(nèi)毒素血癥是膿毒癥，乃至MODS等許多臨床危重癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素，研究其致病機制非常重要。已有許多關(guān)于內(nèi)毒素引起心肺等重要器官功能損害的研究工作，我們推測在內(nèi)毒素血癥情況下骨骼將會出現(xiàn)改變，并由此可能參與了危重病情況下組織、器官功能的變化過程和轉(zhuǎn)歸。 目的： 本研究以內(nèi)毒素血癥小鼠為危重病模型，通過檢測內(nèi)毒素血癥動物模型骨骼(骨細(xì)胞

3、)及相關(guān)基因表達(dá)的變化，探討內(nèi)毒素對骨骼的影響乃至損害情況及機制，為下一步研究骨骼變化在內(nèi)毒素血癥等重癥情況下對機體其它臟器及全身情況的影響及機制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、內(nèi)毒素血癥小鼠模型的制作及評價：腹腔注射LPS的方法制作內(nèi)毒素血癥小鼠模型，LPS按小鼠體重15mg/Kg腹腔注射，將24只小鼠分為8組：正常對照組，LPS處理小鼠4h組，6h組，8h組，12h組，24h組，48h組和72h組，每組3只，采集血清，應(yīng)用全

4、自動生化分析儀檢測小鼠肝腎功能，并取小鼠的心、肝、肺、腎、腸做病理切片，觀察小鼠臟器損傷程度，用以評價內(nèi)毒素血癥模型。3只小鼠用于白細(xì)胞計數(shù)，18只小鼠用于呼吸頻率的檢測和死亡率的測定。 2、內(nèi)毒素血癥小鼠骨骼相關(guān)變化的檢測：將小鼠分為8組：正常對照組，LPS處理小鼠4h組、6h組、8h組、12h組、24h組、48h組和72h組，每組3只，作HE染色及TRAP染色觀察骨骼病理變化，破骨細(xì)胞變化。于相應(yīng)時間點取脛骨，提取骨骼組織的

5、RNA，檢測基因TLR4、HIF-1α、caspase3、osteocalcin、cathepsin K的mRNA含量的變化。于正常對照組、6h組、24h組和5d組，每組3只，取骨骼做掃描電鏡及透射電鏡，觀察骨骼細(xì)胞的變化。 結(jié)果： 1、內(nèi)毒素血癥小鼠模型的評價：內(nèi)毒素血癥小鼠的一周死亡率為22.2％(4/18)。注射內(nèi)毒素后30min呼吸頻率即出現(xiàn)增高(P<0.05)，1h后增高明顯(P<0.01)，于72h恢復(fù)正常(

6、P>0.05)。LPS4h組白細(xì)胞數(shù)量與正常組比較顯著下降(P<0.01)，之后逐漸升高，于72h時仍顯著升高(P<0.05)。與正常對照組比較，LPS組ALT水平4h組顯著升高(P<0.05)，于8h逐漸下降(P<0.05)，趨于正常。但LPS組BUN水平6h才逐漸升高(P<0.05)，于8hBUN仍顯著增高(P<0.05)，然后下降，12h趨于正常(P>0.05)。 2、內(nèi)毒素血癥小鼠骨骼細(xì)胞的變化：與正常對照組比較，小鼠于

7、注射LPS后4h破骨細(xì)胞開始增加(P<0.05)，6h顯著增多(P<0.01)，并隨著時間逐漸增多。骨骼細(xì)胞的掃描電鏡顯示注射LPS后6h的骨細(xì)胞稍有塌陷，樹突減少；24h的骨細(xì)胞明顯塌陷，樹突減少；5d的小鼠骨細(xì)胞嚴(yán)重塌陷，胞體皺縮成一團(tuán)，呈凋亡表現(xiàn)。正常的成骨細(xì)胞外觀飽滿，成圓柱體，注射LPS后6h、24h的成骨細(xì)胞塌陷，形態(tài)由圓柱形變?yōu)榘鶢?、?d時成骨細(xì)胞變成了扁平狀。注射LPS后6h可見破骨細(xì)胞體積增大，樹突增多，鋪展較好并

8、緊貼于骨表面，在LPS處理24h可見破骨細(xì)胞在骨表面吸收骨基質(zhì)出現(xiàn)的小坑，處理5d時可見在骨表面有被破骨細(xì)胞吸收后的痕跡。透射電鏡顯示：正常骨細(xì)胞外觀飽滿，細(xì)胞器清晰，注射LPS后6h骨細(xì)胞稍有塌陷，染色質(zhì)邊集；注射LPS后24h的小鼠骨細(xì)胞明顯塌陷，低礦化帶增寬，細(xì)胞器減少；LPS處理5d時骨細(xì)胞明顯塌陷，低礦化帶明顯增寬，染色質(zhì)塊狀凝集，呈凋亡表現(xiàn)。正常成骨細(xì)胞細(xì)胞器清晰，細(xì)胞核大，核仁明顯，可見有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，LPS處理6h和

9、24h的小鼠成骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，5d的成骨細(xì)胞細(xì)胞器減少，核仁減少。與正常對照比較，LPS處理6h、24h和5d后的小鼠破骨細(xì)胞鋪展較好，并可見細(xì)胞器增多，線粒體腫脹。 3、內(nèi)毒素血癥小鼠骨骼中基因的變化：與正常對照組相比，內(nèi)毒素作用后6h，LPS受體TLR4mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，在24h達(dá)峰值(P<0.01)，72h仍處在較高水平(P<0.05)。注射LPS4h后與凋亡相關(guān)的基因caspase3的表

10、達(dá)明顯升高(P<0.05)，24h恢復(fù)正常，與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。注射LPS4h后缺氧反應(yīng)基因HIF-1α的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，24h恢復(fù)正常，與正常對照組無顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示HIF-1α與caspase3的表達(dá)有相關(guān)性，呈正相關(guān)，Peason's相關(guān)系數(shù)r=0.71(P<0.05)。與正常對照組相比，注射LPS后4h小鼠的骨基質(zhì)蛋白o(hù)steocalcin的mRNA表達(dá)量明顯降低(

11、P<0.01)，至12h時幾乎無表達(dá)，72h的表達(dá)仍處在極低的水平(P<0.01)。注射LPS后4h和6h，破骨細(xì)胞分泌的cathepsin K mRNA表達(dá)明顯升高(P>0.05)，隨后逐漸恢復(fù)正常。 結(jié)論： 1、本實驗成功制作內(nèi)毒素血癥小鼠模型，為后續(xù)的實驗提供了可靠的模型。 2、內(nèi)毒素對骨骼細(xì)胞均產(chǎn)生了影響：導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡，并且使破骨細(xì)胞數(shù)量增多，功能增強，成骨細(xì)胞塌陷、功能降低。 3、骨骼是內(nèi)毒素