骨髓增生異常綜合征骨髓血管新生及三氧化二砷抗血管新生作用機(jī)理研究.pdf

1、第一部分MDS骨髓血管新生及其調(diào)控機(jī)制初步研究 【目的】 探討骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓是否存在血管新生，及其調(diào)控機(jī)制在MDS發(fā)病機(jī)制、病情進(jìn)展及預(yù)后判斷中的價(jià)值。 【方法】 1、將12例MDS患者根據(jù)病情分成兩組，難治性貧血(RA)、環(huán)狀鐵粒幼細(xì)胞增多性難治性貧血(RAS)分為低危組，原始細(xì)胞增多性難治性貧血(RAEB)和轉(zhuǎn)化型原始細(xì)胞增多性難治性貧血(RAEB．T)為高危組，采用CD34單抗

2、免疫組織化學(xué)染色法標(biāo)記了12例MDS患者和l6例正常人骨髓組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，盲法計(jì)數(shù)骨髓微血管密度(MVD)。 2、用ELISA法測定MDS患者血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)濃度。 3、用流式細(xì)胞儀測定MDS患者及正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞VEGF受體(VEGFRl和VEGFR2)的表達(dá)。 【結(jié)果】 1、MVD結(jié)果：MDS患者骨髓微血管密度(MVD)顯著高于正常對照組(P

3、正常對照組(PO.05)。隨MVD的增高VEGF水平呈升高趨勢(P

4、能是由惡性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同分泌的。 3、VEGFRl和VEGFR2表達(dá)率：VEGFRl陽性表達(dá)率結(jié)果顯示：慢粒組>MDS高危組>MDS低危組>正常組(PO.05)；因此提示患者VEGFR表達(dá)水平與疾病病程有密切關(guān)系。 4、MDS、HL60、K562細(xì)胞株可見VEGFRl以

5、K562細(xì)胞株表達(dá)最高(65.59％)，其次是MDS細(xì)胞株(39.82％)，HL60細(xì)胞株表達(dá)最少(17.52％)。而VEGFR2MDS細(xì)胞株表達(dá)最高(28．53％)，其次是K562細(xì)胞株(14.91％)，HL60細(xì)胞株表達(dá)最少(11.22％)。 【結(jié)論】 1、MDS患者存在骨髓微血管密度增高，并與MDS患者的疾病進(jìn)展正相關(guān)，血管新生在MDS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用；2、MDS患者血清中VEGF濃度和VEGFRl陽性表達(dá)

6、增高也與骨髓微血管密度正相關(guān)，提示二者在參與MDS的血管新生中起重要作用。3、VEGFR2表達(dá)率與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 第二部分AS203抗血管新生作用機(jī)理的體外研究 【目的】 研究三氧化二砷(As203)通過抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生長，下調(diào)HUVEC細(xì)胞株及SKM．1細(xì)胞株VEGFmRNA表達(dá)來起到抗血管新生作用。 【方法】 1.研究對象：研究對象為HUVEC和SKM．1細(xì)胞株(MDS

7、RAEB)。 2．實(shí)驗(yàn)分組：A組是不同濃度的As203與HUVEC共同孵育；B組是HUVEC與SKM．1細(xì)胞株的培養(yǎng)上清液共同培養(yǎng)；C組是SKM．1細(xì)胞。 3．A、B組與不同濃度的A8203共同孵育3天后，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用四唑鹽比色法(MTT)繪制細(xì)胞生長曲線圖，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，研究As203對它的生長抑制作用。 4．不同濃度的As203分別干預(yù)A組、B組和C組共同孵育1天后，用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT

8、-PCR)擴(kuò)增VEGF基因片段，分析VEGFmRNA表達(dá)變化。 5．相同濃度的As203分別干預(yù)A、B、C三組12、24、36、48、60、72小時(shí)后，用逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增VEGF基因片段，分析VEGFmRNA表達(dá)變化。 【結(jié)果】 1．低濃度的As203(0-1.51μmol/1)對A組和B組均無明顯生長抑制作用(F=O.324，P>0.05)；相對高濃度(3-481μmol/1)的As20

9、3處理A組和B組均有明顯生長抑制作用，藥物濃度與細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)(P<0.05)。 2．As203作用于A組和B組不同時(shí)間，其生長抑制作用隨著藥物作用時(shí)間增加細(xì)胞抑制作用也逐漸明顯(F=10.92，P<0.01)。 3．HUVEC中加入SKM-l上清液共同培養(yǎng)對促進(jìn)細(xì)胞生長有明顯作用(F=28，P<0.01)。 4．通過分析VEGFmRNA隨As203作用濃度和時(shí)間改變表達(dá)發(fā)生相應(yīng)變化，分析認(rèn)為： (1

10、)B組VEGFmRNA表達(dá)顯著高于A組(t=3.402，P<0.05)； (2)隨As203作用濃度和時(shí)間的增加，A、B、C三組的VEGFmRNA表達(dá)均逐漸下降，呈顯著的負(fù)性相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。 【結(jié)論】 三氧化二砷以時(shí)間-劑量依賴性方式抑制HUVEC細(xì)胞的生長，并且下調(diào)它和SKM.1細(xì)胞的VEGFmRNA的表達(dá)；MDS細(xì)胞本身VEGFmRNA高表達(dá)，并且它可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖和VEGFmRNA表達(dá)。因