Th17細(xì)胞-白介素-17在病毒性心臟病中的作用及機制研究.pdf

1、病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由各種病毒感染引起的以心肌局灶性或彌漫性壞死為特征，伴隨心肌間質(zhì)的非特異性急、慢性炎癥反應(yīng)、纖維化或心臟擴張等臨床表現(xiàn)的常見疾病。VMC好發(fā)于青壯年，其發(fā)病有逐年升高的趨勢。絕大多數(shù)VMC可以自愈，但是15～25％VMC患者可演變?yōu)閿U張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)，最終導(dǎo)致心力衰竭或惡性心律失常，其預(yù)后不良，病死率較高。Rose根據(jù)不同類型免

2、疫細(xì)胞浸潤將心肌炎分為淋巴細(xì)胞性心肌炎、巨細(xì)胞性心肌炎、嗜酸粒細(xì)胞性心肌炎和DCM等類型，同時國內(nèi)外學(xué)者將VMC分為病毒復(fù)制期、免疫反應(yīng)期和DCM期。因此，免疫損傷機制在VMC中起著重要的作用。既往研究認(rèn)為，病毒感染機體后，急性期大量病毒在宿主心肌細(xì)胞中復(fù)制，直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷、壞死及凋亡。而在急性期后若病毒未被機體清除，一方面病毒在心肌細(xì)胞中持續(xù)低水平復(fù)制，可以繼續(xù)直接損傷心肌結(jié)構(gòu)及功能；另一方面也可通過激活并維持免疫反應(yīng)而導(dǎo)致心

3、肌進一步損傷。因此本研究主要從VMC發(fā)生、發(fā)展及演變過程中可能存在的免疫機制為線索，探索細(xì)胞免疫在VMC發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，為VMC的早期臨床診斷及探尋免疫治療的新靶點提供理論依據(jù)。
　　 在經(jīng)典的輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞亞群Th1/Th2的研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一種新型的Th17細(xì)胞亞群，其分化發(fā)育和功能特征明顯不同于之前發(fā)現(xiàn)的輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1和Th2。Th17細(xì)胞的分化發(fā)育依賴于局部微環(huán)境及特定細(xì)胞因子的作用，其主

4、要分泌的效應(yīng)分子為IL-17A/F、IL-22和IL-21。最初的研究認(rèn)為，VMC機體中CD4+T細(xì)胞向Th1分化增加，分泌IFN-γ以降低病毒的復(fù)制，從而減少心肌免疫細(xì)胞的浸潤及炎癥刺激，并導(dǎo)致心肌纖維化的程度減輕，保護心肌細(xì)胞避免過度免疫損傷并降低心肌纖維化的程度。此外，有研究表明心肌炎的病理損傷與Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)。目前研究認(rèn)為，Th17與機體抗病原體感染及一些自身免疫病密切相關(guān)，即Th17細(xì)胞可誘導(dǎo)機體局部組織的炎癥反

5、應(yīng)的發(fā)生、放大和級聯(lián)反應(yīng)，繼而加重其病理類型的發(fā)生與發(fā)展。近年來，Th17細(xì)胞在自身免疫性心肌炎中的作用已成為心血管疾病研究的熱點，在實驗性自身免疫性心肌炎中的研究也取得了一定的進展。而VMC與實驗性自身免疫性心肌炎在病理類型、臨床表現(xiàn)、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后上具有相同之處。那么，Th17細(xì)胞在機體受到病毒感染后的作用如何?當(dāng)柯薩奇病毒感染后心肌局部炎癥發(fā)生、發(fā)展及演變中的作用機制如何?同時Treg細(xì)胞亞群具有免疫抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞群，在免

6、疫炎癥性疾病中具有保護作用。Treg和Th17均起源于CD4+T細(xì)胞亞群，在特定地局部免疫微環(huán)境作用下，二者可以相互轉(zhuǎn)化、相互制衡。Th17/Treg細(xì)胞亞群失衡在多種自身免疫性疾病中受到了廣泛地關(guān)注，那么，VMC與其它類型的自身免疫性疾病一樣也存在Th17/Treg失衡現(xiàn)象?國內(nèi)外學(xué)者尚缺乏深入地闡述和研究。
　　 在病毒性心肌炎向擴張型心肌病的演變過程中，心肌炎癥是病毒感染導(dǎo)致心肌纖維化、心室重構(gòu)和心力衰竭的共同通路，而心肌

7、炎癥反應(yīng)主要依賴于不同類型的免疫細(xì)胞浸潤，形成不同的局部免疫微環(huán)境。目前在不同T淋巴細(xì)胞亞群在VMC中的作用及其機制研究甚少，特別是Th17細(xì)胞在VMC細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分解和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)中作用的研究更少。因此，本研究通過探索Th17細(xì)胞在心肌組織局部微環(huán)境對心肌ECM的合成與分解和基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)中的作用機制，有利于尋找VMC的免疫診斷與治療的新途徑。
　　 柯薩奇B3病毒感染的小鼠在不同時期的心肌標(biāo)本中有多種

8、免疫細(xì)胞浸潤，其中以大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，伴隨少量的B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)和自然殺傷細(xì)胞。其中DC作為抗原提呈細(xì)胞，可以捕獲提呈抗原，并逐漸演變?yōu)槌墒斓腄C，在體內(nèi)遷移，最終激活免疫反應(yīng)。那么，DC在VMC的病因中的作用尚未清楚，但是DC從外周組織沿傳入淋巴管遷移至鄰近的次級淋巴組織后，與抗原特異性的初始T淋巴細(xì)胞聚集，誘導(dǎo)其活化并增殖，使其分化為效應(yīng)性T細(xì)胞，從而啟動機體的一系列免

9、疫應(yīng)答。隨著新型免疫細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)及Th17/Treg調(diào)節(jié)機制的不斷深入研究，DC在病毒性心臟病的發(fā)病機制也受到廣泛地重視。因此，DC在VMC的發(fā)生、發(fā)展、演變及轉(zhuǎn)歸等方面的作用，特別是在病毒性心臟病中Th17/Treg細(xì)胞亞群分化的作用機制等方面，值得我們進一步研究與探索。
　　 本研究致力于探討Th17細(xì)胞在急性病毒性心肌炎中的作用機制，特別是與其它細(xì)胞亞群的關(guān)系，如Treg細(xì)胞亞群；闡述Th17細(xì)胞在病毒性心肌炎向心肌纖維

10、化演變過程中的作用機制，并探索DC在病毒性心臟病中Th17/Treg細(xì)胞亞群分化中的調(diào)節(jié)作用，以尋求臨床上有效的免疫治療靶點。全文共分為以下四部分：
　　 第一部分 CVB3致小鼠病毒性心肌炎、擴張型心肌病模型的建立
　　 目的:建立小鼠急、慢性心肌炎和擴張型心肌病動物模型。
　　 方法:雄性Balb/c小鼠210只，體重12～16g，隨機設(shè)立病毒感染后不同時間點，分別為0天組(n=35)、7天組(n=35)、1

11、0天組(n=35)、14天組(n=35)、2月組(n=35)和3月組(n=35)。每組隨機抽取10只，腹腔注射不含病毒的Eagel's培養(yǎng)液(EMEM)，作為正常對照組(Control group)；其余小鼠腹腔均接種柯薩奇病毒B3(CVB3)建立小鼠急、慢性心肌炎和擴張型心肌病動物模型；分別于接種病毒后第0、7、10與14天及2月、3月末處死動物并收集外周血、血清、脾臟及心臟組織等標(biāo)本；于感染后第7天、2月、3月末動物模型組與同期對照

12、組小鼠分別進行心臟超聲檢查、病理學(xué)染色并計算心肌膠原容積積分。
　　 結(jié)果:小鼠心肌在感染后第7天出現(xiàn)心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)充滿炎性細(xì)胞浸潤，伴心肌纖維化增生，主要以局限在心肌壞死灶周邊；計算心肌病理積分結(jié)果顯示，在感染后第7天明顯升高，第10天最高，第14天后開始下降。而CVB3復(fù)制水平在感染后第7天最高。至第2月末感染小鼠出現(xiàn)心肌纖維斷裂，心肌內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，心肌間質(zhì)纖維化增加，心腔擴大及心臟收縮及舒張功能均減

13、退；第3月末小鼠心肌間質(zhì)大量膠原異常增生呈彌漫性分布，心肌炎性細(xì)胞浸潤減少，左室腔明顯擴大，心臟舒張功能顯著減退；同時心肌膠原容積積分明顯升高。
　　 結(jié)論:以CVB3單次和增量重復(fù)感染Balb/c小鼠成功建立了急、慢性病毒性心肌炎和擴張型心肌病動物模型。在急性病毒性心肌炎中，以感染后第7～10天心肌病理損傷最為明顯，CVB3病毒復(fù)制水平在第7天最高。在慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病中，以感染后第2個月后心臟結(jié)構(gòu)與功能顯著減退，

14、但心肌膠原容積積分以第3個月最為顯著。
　　 第二部分 Th17細(xì)胞在急性病毒性心肌炎中的作用機制及對Treg細(xì)胞的影響
　　 目的:探討Th17細(xì)胞/白介素-17在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對Treg細(xì)胞亞群的影響。
　　 方法:首先采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分別檢測正常對照組、急性病毒性心肌炎組(0、7、10、14天)脾臟中Th17細(xì)胞的表達，同時使用Real-time PCR技術(shù)檢測急性心肌炎心肌組織中CVB

15、3病毒復(fù)制水平與IL-17、TGF-β表達并進行相關(guān)性分析。采用激光共聚焦顯微鏡及酶聯(lián)免疫吸附試驗方法分別觀察Th17、Treg細(xì)胞在心肌組織及外周血清中IL-17、TGF-β的表達水平。分別對各組小鼠心肌組織進行HE染色計算心肌損傷的病理積分，使用Real-time PCR檢測病毒復(fù)制水平。再將Balb/c小鼠70只，隨機分為對照組(Control)(n=10)、急性心肌炎組(AVMC)(n=20)、Isotype組(n=20)及An

16、ti-IL-17組(n=20)。Control組小鼠腹腔注射等量EMEM；而AVMC、Isotype及Anti-IL-17A組小鼠均腹腔接種CVB3；然后Isotype及Anti-IL-17組小鼠于病毒感染后隔日分別腹腔注射IgG(100μg)、IL-17Ab(100μg)。所有小鼠均于病毒感染第7天后處死并取心臟組織、血清及脾臟組織；采用流式細(xì)胞儀測定CD4+，CD8+，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，并檢測CD4+Perforin

17、+T淋巴細(xì)胞，CD8+Perforin+T淋巴細(xì)胞，CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細(xì)胞的表達量。使用Real-time PCR檢測心肌組織中IL-17A及CVB3病毒復(fù)制水平，并使用H&E染色計算心肌病理積分觀察各組心肌損傷的程度，最后采用Western blot法檢測心肌組織中IFN-γ、TGF-β1及VP1等蛋白表達水平，Cytomix方法檢測血清中T細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子的表達譜。
　　 結(jié)果:急性病毒性心肌炎感染后第

18、7、10及14天脾臟中Th17細(xì)胞數(shù)較正常對照組明顯增加，其中以第10天增加最為明顯，Real-time PCR實驗結(jié)果顯示心肌組織中IL-17A mRNA及CVB3 RNA水平表達均升高，二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系。而心肌組織中TGF-β mRNA在心肌中的表達也呈明顯升高趨勢，但是與CVB3RNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；結(jié)合Western-blot及Cytomix方法檢測心肌組織及血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A，IL-6，IL-21

19、，IL-10，IFN-γ和IL-2的表達水平，與正常對照組相比，這些細(xì)胞因子的表達均明顯升高。在急性病毒性心肌炎模型中，心肌組織H&E染色計算病理積分結(jié)果顯示，感染后第10天心肌損傷最重，而CVB3病毒復(fù)制在第7天最明顯。采用IL-17A中和抗體干預(yù)后，結(jié)果顯示IL-17A能夠改善急性病毒性心肌炎心肌病理損傷程度，并能夠降低心肌CVB3病毒復(fù)制水平；結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)及Western blot檢測結(jié)果顯示，IL-17A中和抗體干預(yù)能夠顯著

20、降低Treg細(xì)胞、提高體內(nèi)CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及穿孔素的表達水平，使Treg細(xì)胞導(dǎo)致殺傷性T細(xì)胞的抑制功能恢復(fù)；同時上調(diào)心肌組織中IFN-γ的表達。從血清學(xué)的檢測結(jié)果也顯示，IL-17A中和抗體干預(yù)使體內(nèi)Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17A及IL-22的表達明顯下降，而IFN-γ的表達卻明顯升高。
　　 結(jié)論:急性病毒性心肌炎模型中小鼠脾臟Th17細(xì)胞及心肌中IL-17A表達與正常對照組比較明顯增加。同時在急性心肌炎

21、心肌組織中IL-17A mRNA的水平與CVB3病毒復(fù)制水平升高，二者呈正相關(guān)關(guān)系；而TGF-β mRNA在心肌中的表達也呈上升趨勢，但是與CVB3復(fù)制水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中在感染后第10天Th17細(xì)胞表達最多，而CVB3病毒復(fù)制水平在第7天最高。IL-17A中和抗體明顯改善急性病毒性心肌炎的病毒復(fù)制水平及心肌病理損傷程度，這一過程的作用機制可能是通過IL-17中和抗體減輕Treg細(xì)胞過度抑制殺傷性T細(xì)胞效應(yīng)及促進IFN-γ的表達增加有

22、關(guān)。
　　 第三部分：Th17細(xì)胞/IL-17在心肌炎向心肌纖維化演變中的作用及機制研究
　　 目的:研究阻斷IL-17R干預(yù)IL-17后，對急性心肌炎后向心肌纖維化演變過程中的作用及機制研究。
　　 方法:體內(nèi)試驗：將Balb/c小鼠50只，隨機分為3組，即慢性病毒性心肌炎組(n=10)，慢性病毒性心肌炎+AdIL-17R：Fc組(n=20)，慢性病毒性心肌炎+Ad：null組(n=20)。慢性病毒性心肌炎+A

23、dIL-17R：Fc組及慢性病毒性心肌炎+Ad：null組給予腹腔接種CVB3后，分別給予Ad：IL-17R：Fc及等量Ad：Fc；觀察各組小鼠死亡率，并在3個月末進行心超檢查后處死小鼠，采用天狼猩紅染色及免疫組織化學(xué)方法檢測心肌內(nèi)膠原含量并運用圖像分析軟件計算CVF和Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量；使用ELISA方法測定血清中IL-6及TNF-α的含量，采用Western blot檢測小鼠心肌組織中TGF-β1、IL-17A、ADAMTS-1及M

24、MP-2/TIMP-1的表達水平，同時采用Real-time PCR方法檢測Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達水平。
　　 體外試驗：使用不同濃度IL-17A細(xì)胞因子作用于體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞，了解其對細(xì)胞增殖及心臟細(xì)胞外基質(zhì)中重要的金屬蛋白酶ADAMTS-1及MMPs/TIMPs表達的影響，同時測定心肌成纖維細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA水平變化，最后使用Real-time PCR方法觀察IL-17A對心肌成纖維細(xì)胞中ADAMTS-

25、1的作用是否通過ERK、p38、JNK MAPK的磷酸化修飾來實現(xiàn)的。
　　 結(jié)果:使用流式細(xì)胞儀方法檢測病毒感染后第2月、3月不同時間段Th17細(xì)胞的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，Th17細(xì)胞在第2月上升最為明顯；采用AdIL-17R：Fc干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)明顯提高了小鼠的生存率(44％ VS20％，p<0.05)；降低慢性心肌炎小鼠血清中IL-6和TNF-α細(xì)胞因子的水平；同時降低小鼠心肌組織中IL-17A的表達，而對IL-

26、17RA的表達無明顯影響。通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測外周Th17細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdIL-17R：Fc能夠降低外周脾臟中Th17細(xì)胞(7.88±1.01％ VS10.3±1.67％，p<0.05)的表達。從心臟功能及形態(tài)學(xué)結(jié)果上發(fā)現(xiàn)，AdIL-17R：Fc能夠改善心功能并減輕心臟過度擴大，明顯降低心臟/體重比值。從心肌組織病理學(xué)檢測結(jié)果表明：AdIL-17R：Fc顯著降低心肌組織中CVF(4.27VS8.7，p<0.05)及Ⅰ型、Ⅲ型膠原在心

27、肌組織中的沉積。經(jīng)過蛋白印跡定量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AdIL-17R：Fc能抑制心肌ADAMTS-1和MMP-2蛋白的表達，而對TIMP-1的表達無明顯影響；體外實驗研究結(jié)果顯示：IL-17A細(xì)胞因子能促進ADAMTS-1、MMP-2及TIMP-1的蛋白表達，并刺激心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達增加；同時促進心肌成纖維細(xì)胞的增殖。進一步通過體外實驗進一步探索IL-17A對心肌成纖維細(xì)胞ADAMTS-1作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果顯示：IL-1

28、7A通過p38及ERK磷酸化途徑影響ADAMTS-1 mRNA水平的表達；而不是通過JNK的磷酸化途徑來實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論:在慢性病毒性心肌炎及擴張型心肌病中，脾臟Th17細(xì)胞及心肌中IL-17A表達與正常對照組比較明顯增加，而在感染后第2月Th17細(xì)胞數(shù)量較同期對照組明顯上升，而感染后第3月有所下降。同時第2～3月心肌損傷及纖維化程度較同期對照組明顯增加，并且在感染后第3月的增加更為明顯。AdIL-17R：Fc干預(yù)后結(jié)果顯示

29、：AdIL-17R：Fc能降低擴張型心肌病小鼠死亡率及減輕心肌纖維化的機制，可能與其抑制Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17A細(xì)胞因子后產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。同時AdIL-17R：Fc使心肌組織中ADAMTS-1、MMP-2/TIMP-1表達明顯下降，減輕其對心肌細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用，從而減少心肌細(xì)胞外基質(zhì)的破壞及降低心肌纖維化。另外在體外實驗也證明，IL-17A在心肌成纖維細(xì)胞中對ADAMTS-1作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與p38及ERK MAP

30、K磷酸化密切相關(guān)，驗證了體內(nèi)實驗中AdIL-17R：Fc可能導(dǎo)致IL-17A的產(chǎn)生，進一步降低細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而產(chǎn)生抗纖維化的保護作用。
　　 第四部分 DC在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對T細(xì)胞分化為Th17、Treg細(xì)胞亞群的影響
　　 目的:探討DC在急性病毒性心肌炎中的作用機制及其對T細(xì)胞向Th17、Treg細(xì)胞亞群分化的影響。
　　 方法:通過采集正常對照組(n=15)、急性病毒性心肌炎組(n=

31、15)小鼠骨髓來源的DC進行原代培養(yǎng)，并對成熟的DC進行影像學(xué)及流式細(xì)胞儀鑒定DC表面分子標(biāo)記物的表達。提取正常對照組小鼠外周脾臟組織CD4+T細(xì)胞，并使用磁珠分選后CD4+T細(xì)胞，重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液，待與DC細(xì)胞共培養(yǎng)使用。然后采集正常對照組及急性病毒性心肌炎組小鼠骨髓來源的DC，并使用磁珠分選兩組來源的DC后，與分選后CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，并將不同組T淋巴細(xì)胞進行體外定向Th17及Treg細(xì)胞亞群分化。采用流式細(xì)胞技術(shù)及

32、ELISA方法檢測Th17、Treg細(xì)胞的數(shù)量及上清夜中IL-17A和TGF-β的含量，并使用細(xì)胞增殖實驗(CCK-8)了解負(fù)載病毒抗原DC對CD4+T細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:首先在小鼠骨髓來源的DC原代培養(yǎng)后觀察，DC早期呈現(xiàn)貼壁生長方式，第2～3天后呈現(xiàn)多處集落生長，并且可見出芽狀的突起，5～7天后集落漸漸減少，突起變長，呈懸浮生長方式，即從未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)化為成熟狀態(tài)的DC。采用流式細(xì)胞技術(shù)對急性病毒性心肌炎骨髓來源的D

33、C表面分子標(biāo)志物檢測，結(jié)果顯示CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表達比正常對照組明顯增加，而CD86表面分子在二者之間未見顯著性差異。在小鼠外周脾臟組織提取CD4+T細(xì)胞，使用磁珠分選的后CD4+T、DC細(xì)胞的純度分別達到92％和95％，然后將來源于不同組別提取的DC向Th17和Treg細(xì)胞定向分化培養(yǎng)，結(jié)果顯示：負(fù)載病毒抗原的DC能夠刺激CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖增加；同時促進CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞亞群分化增加，與對照組相比，有顯著

34、統(tǒng)計學(xué)意義；而二者在向Treg細(xì)胞亞群分化中，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:急性病毒性心肌炎模型中骨髓來源的DC的成熟度與正常對照組比較明顯增加。同時采用體外共培養(yǎng)及定向分化實驗，結(jié)果表明：柯薩奇病毒感染機體后，能促進CD4+T細(xì)胞的增殖，并且促使初始T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化增加，而向Treg細(xì)胞亞群分化不明顯。因此，在急性病毒性心肌炎模型中，Th17細(xì)胞亞群的增加可能與負(fù)載病毒抗原DC的遞呈作用有關(guān)，而這種作用可能是促使