柯薩奇—腺病毒受體在病毒性心臟病中的表達及黃芪甲甙的干預研究.pdf

1、目的:柯薩奇-腺病毒受體(CAR)是一種含365個氨基酸的跨膜糖蛋白，為柯薩奇B組病毒(CVB)與腺病毒(ADV)的共同受體，在它們感染心肌細胞的過程中起著重要的介導作用。研究CAR在小鼠病毒性心肌炎(VMC)中表達的動力學特征，探討其在病毒性心肌炎發(fā)病學中的意義及黃芪甲甙干預治療對CAR表達的影響?！　》椒?取BALB/C小鼠80只，分為實驗組70只，對照組10只。實驗組小鼠每只腹腔注射0.1mL內(nèi)含1×102TCID50CVB3的

2、Eagle's培養(yǎng)液，對照組小鼠每只腹腔注射不含病毒的Eagle's培養(yǎng)液0.1mL。實驗組小鼠分別于接種病毒后3、7、15、30d隨機各取10只處死，對照組小鼠在接種后30天處死作為總體對照。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫組化等方法半定量檢測VMC小鼠不同時點心肌CAR基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平，同時應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)檢測血清IL-1β濃度；取20只小鼠隨機等分為對照組和重組IL-1β(rIL-1β)組，r

3、IL-1β組皮下注射rIL-1β，1μg/0.1mL，對照組注射等量PBS，均連續(xù)使用5天，第10天處死全部小鼠并取其心臟，用RT-PCR及免疫組化半定量分析CARmRNA及蛋白表達水平；取BALB/C小鼠100只，隨機分成6組。非感染小鼠腹腔無菌注射不含病毒的Eagle's培養(yǎng)液0.1mL，分為正常對照組(A組，10只，以羧甲基纖維素鈉0.1mL灌胃7d)、高劑量對照組(B組，10只，9％黃芪甲甙0.1mL灌胃7d)；余80只小鼠以腹

4、腔無菌注射0.1mL內(nèi)含1×102TCID50CVB3的Eagle's培養(yǎng)液制作VMC模型，VMC小鼠隨機分為心肌炎對照組和低、中、高劑量干預組，分別以生理鹽水、1％、3％、9％黃芪甲甙(分別為0.07、0.2、0.6g/kg.d)0.1mL灌胃7d(分別為C、D、E、F組，每組20只)。14d后處死全部小鼠并取其心臟。采用RT-PCR及免疫組化分別檢測心肌CARmRNA及蛋白表達水平?！　〗Y(jié)果：VMC小鼠在接種病毒后3d心肌CARm

5、RNA及蛋白表達水平升高，7d表達水平最高，此后其表達逐漸下降，但30d仍維持在一個較高水平，各時點CARmRNA及蛋白表達水平與對照組相比，差異均有顯著性(P＜0.05或0.01)，并且CAR蛋白表達水平與心肌病變積分呈顯著正相關(guān)(r=0.91，P＜0.05)，與對照組比較，小鼠接種病毒后第3～30d血清IL-1β濃度均明顯升高(P＜0.05或0.01)，高峰在接種后7d，而且血清IL-1β濃度變化與CAR表達水平及心肌炎癥病理改變呈

6、現(xiàn)出明顯的一致性；rIL-1β組心肌CARmRNA及蛋白表達水平均明顯高于對照組，兩組比較，差異有顯著性(P＜0.01)；正常對照組和高劑量對照組無小鼠死亡，然而心肌炎對照組有大量小鼠死亡，死亡率為45％(9/20)，低、中、高劑量干預組小鼠死亡率分別為30％(6/20)、25％(5/20)、10％(2/20)，高劑量干預組小鼠死亡率較心肌炎對照組明顯降低(P＜0.05)，而低、中劑量干預組小鼠死亡率與心肌炎對照組比較，差異無顯著性(P

7、＞0.05)；正常對照組和高劑量對照組心肌未見任何病理改變，然而兩組心肌中均有一定量的CARmRNA及蛋白表達，兩組比較，差異無顯著性(P＞0.05)，心肌炎對照組CARmRNA及蛋白表達水平明顯增加，與正常對照組比較，差異有高度顯著性(P＜0.01)，心肌炎小鼠經(jīng)不同劑量黃芪甲甙干預后，與對照組相比，在高劑量干預組顯著下降(P＜0.01)，而低、中劑量黃芪甲甙對心肌炎小鼠CARmRNA、蛋白表達水平以及心肌病變積分無明顯影響(P＞0.

8、05)?！　〗Y(jié)論：CVB3病毒感染可引起CAR表達上調(diào)，CAR表達受IL-1β等炎癥介質(zhì)調(diào)控，CAR表達增加可能在CVB3病毒性心肌炎發(fā)病機制中起重要作用。黃芪甲甙治療病毒性心肌炎可能通過抑制炎癥介質(zhì)、降低CAR的表達而起作用?！　∧康模簲U張型心肌病(DCM)約30％是由病毒性心肌炎演變而成，可能是病毒持續(xù)感染的結(jié)果?？滤_奇B組病毒(CVB)和腺病毒(ADV)是引起病毒性DCM最常見的兩種病原體，近年來研究證明，CVB或ADV與心肌

9、細胞的結(jié)合及其隨后的病毒內(nèi)在化必須通過柯薩奇-腺病毒受體(CAR)的介導。觀察CAR在病毒性DCM心肌組織中的表達情況，探討CAR在病毒性DCM發(fā)病機制中的意義。　　方法：采用RT-PCR及PCR技術(shù)分別檢測因終末期DCM行心臟移植術(shù)的20例心肌標本中的CVB、ADV基因，根據(jù)病毒基因檢測結(jié)果將20例DCM標本分為柯薩奇病毒組(CVB陽性)、腺病毒組(ADV陽性)及其它組(CVB、ADV均陰性)，另外選擇同期腦死亡3h內(nèi)排除心臟疾患的

10、心臟標本5例作為正常對照組，采用免疫組化及RT-PCR等方法半定量檢測各組心肌中CARmRNA及蛋白表達水平，并與心功能(EF)進行相關(guān)性分析。　　結(jié)果：20例DCM心肌標本中，CVB陽性7例，ADV陽性5例；其余8例CVB、ADV均陰性，另外5例正常對照CVB、ADV也均為陰性，因而根據(jù)病毒基因檢測結(jié)果可分為柯薩奇病毒組(7例)、腺病毒組(5例)、其它組(8例)及對照組(5例)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組和其它組心肌中CARm

11、RNA表達水平很低，兩組比較，差異無顯著性(P＞0.05)，然而柯薩奇病毒組和腺病毒組心肌CARmRNA表達水平明顯增加，與對照組或其它組比較，差異均有顯著性(P均＜0.01)，但柯薩奇病毒組與腺病毒組相比，兩組比較，差異無顯著性(P＞0.05)；免疫組化染色表明，對照組和其它組心肌CAR蛋白表達水平均很低，兩組比較，差異無顯著性(P＞0.05)，然而柯薩奇病毒組及腺病毒組CAR蛋白表達水平亦明顯增加，且陽性顆粒主要位于潤盤和肌膜處，與