黃芪甲甙體外抗乙型肝炎病毒的作用.pdf

1、乙型肝炎病毒（HBV）感染會(huì)導(dǎo)致慢性乙型肝炎(CHB)的發(fā)生，同時(shí)也是引起肝硬化、肝細(xì)胞癌的重要相關(guān)因素。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，全世界有20多億人為HBV病毒感染者，其中約有4億人為慢性感染者。估計(jì)，每年超過50萬人死于HBV感染所導(dǎo)致的肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌。中國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，約有10％的人口為HBV攜帶者，HBV感染帶來的健康和經(jīng)濟(jì)問題已成為憂國(guó)憂民的難題。20世紀(jì)90年代以來，重組干擾素及核苷類似物藥物的開發(fā)與應(yīng)用，使C

2、HB的治療取得了一定進(jìn)展，但是這些藥物存在不能完全清除病毒、易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用大及藥價(jià)昂貴等一系列問題。因此，迫切需要尋求高效、安全、廉價(jià)的抗HBV藥物。近年來，中醫(yī)藥在治療HBV方面顯示出很大潛力。現(xiàn)已證明，一些中藥單體如：青蒿素、苦參堿和苦參堿脂質(zhì)體、木香烯內(nèi)酯、珍珠草提取物鞣花酸及虎杖提取物白藜蘆醇等在體外試驗(yàn)中對(duì)乙肝病毒均有不同程度的抑制作用。
　　黃芪為豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根，含有多糖、黃酮、皂

3、甙、氨基酸和十幾種微量元素等多種成份。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中含有多種抗病毒成份。黃芪甲甙是黃芪皂甙類有效單體成份，有抗炎、抗高血壓、糖尿病和抗病毒等廣泛的藥理作用。但其抗HBV作用的實(shí)驗(yàn)研究未見報(bào)道。本研究擬通過觀察黃芪甲甙對(duì)體外HBV的作用，以期為黃芪甲甙的進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)，也為我國(guó)抗HBV新藥研制提供一些思路。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
　　實(shí)驗(yàn)一HepG2.2.15細(xì)胞株的檢測(cè)，HBsAg和HBeAg檢測(cè)
　　目的：

4、觀察HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的分泌。
　　方法：培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)ELISA試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照劑為陽(yáng)性對(duì)照，含血清培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，第10天、20天、30天的HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液為實(shí)驗(yàn)組。使用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的HBsAg或HBeAg，顯色反應(yīng)完成后選用450nm波長(zhǎng)在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取各孔A值。
　　結(jié)果：HepG2.2.15細(xì)胞能穩(wěn)定地分泌HBsAg和HBe

5、Ag，且與時(shí)間成正相關(guān)。
　　結(jié)論：在本次實(shí)驗(yàn)，HepG2.2.15細(xì)胞分泌穩(wěn)定，是良好的體外模型。
　　實(shí)驗(yàn)二黃芪甲甙體外抗乙型肝炎病毒的作用
　　1、藥物對(duì)細(xì)胞的毒性試驗(yàn)
　　目的：觀察黃芪甲甙對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用。
　　方法：用不同濃度黃芪甲甙培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)，設(shè)濃度為10mg/L、5.0mg/L和1.0mg/L拉米夫定為陽(yáng)性對(duì)照組和僅加細(xì)胞培養(yǎng)液的陰性對(duì)照組。在第9天，用3-(4

6、,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）比色法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。
　　結(jié)果：濃度為100mg/L和50mg/L的黃芪甲甙對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的抑制率分別為50.6％和35.1％,TC50（半數(shù)毒性劑量）為97.4mg/L。拉米夫定在10mg/L～1.0mg/L濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率為10.5％～6.9％。
　　結(jié)論：黃芪甲甙對(duì)細(xì)胞的毒性作用非常小。拉米夫定在本實(shí)驗(yàn)濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)未見明顯毒性作用。

7、>　　2、HBsAg和HBeAg的測(cè)定
　　目的：探討黃芪甲甙對(duì)培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。
　　方法：使用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的HBsAg或HBeAg。顯色反應(yīng)完成后選用450nm波長(zhǎng)在自動(dòng)酶標(biāo)儀上讀取各孔A值，計(jì)算抗原抑制率。
　　結(jié)果：不同濃度黃芪甲甙和拉米夫定對(duì)HBsAg和HBeAg分泌均有一定抑制作用，且隨劑量的增加，治療時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用也隨之增加。黃芪甲甙給藥6日，其HBsAg和

8、HBeAg的50％抑制濃度（IC50）分別為53.5mg/L和59.4mg/L；給藥9日，其HBsAg和HBeAg的IC50分別為22.1mg/L和26.2mg/L。在第9日，黃芪甲甙的HBsAg和HBeAg治療指數(shù)（TI）分別為4.4和3.7。拉米夫定給藥6日，其HBsAg和HBeAg的抑制率分別為：25.3％～3.5％和39.6％～3.6％；給藥9日，其HBsAg和HBeAg的抑制率分別為：35.2％～2.7％和43％～4.2％。<

9、br>　　結(jié)論：黃芪甲甙和拉米夫定對(duì)培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用，且與劑量-時(shí)間成正相關(guān)。
　　3、HBVDNA的檢測(cè)
　　目的：探討黃芪甲甙對(duì)培養(yǎng)上清中HBVDNA分泌的作用。
　　方法：采用熒光定量PCR法分析黃芪甲甙對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA含量的影響。
　　結(jié)果：黃芪甲甙和拉米夫定均有一定程度的抗HBVDNA的作用。黃芪甲甙給藥6日，其HBVDNA的IC50為39.9mg/