荔枝核總皂苷體外抗乙型肝炎病毒的作用.pdf

1、荔枝核作為常用的中草藥之一，主要用于治療與肝臟相關(guān)的疾患。其化學(xué)成分包括皂苷、蒜質(zhì)和脂肪酸等多種物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核黃酮類(lèi)提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，乙型肝炎e抗原(HBeAg)以及細(xì)胞外HBVDNA有明顯的抑制作用；那么作為荔枝核主要化學(xué)成分之一的皂苷，是否同樣具有抗HBV的作用，目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　轉(zhuǎn)基因HepG2.2.15細(xì)胞株載有HBV全基因組，能夠進(jìn)行病毒復(fù)制并穩(wěn)

2、定分泌感染性病毒顆粒及HBsAg和HBeAg，因此被廣泛用于抗病毒藥物的篩選和療效評(píng)價(jià)。
　　我們以HepG2.2.15細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用MTT比色法觀察不同濃度荔枝核總皂苷對(duì)細(xì)胞的毒性作用；并分別采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg，HBeAg及細(xì)胞外HBVDNA的含量，以此評(píng)價(jià)荔枝核總皂苷體外抗HBV的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下：
　　實(shí)驗(yàn)一：HepG2.2.15

3、細(xì)胞株培養(yǎng)體系的建立
　　目的：使HepG2.2.15細(xì)胞正常生長(zhǎng)，為其后荔枝核總皂苷的藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　方法：分為細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存四個(gè)步驟。
　　結(jié)果：細(xì)胞復(fù)蘇后三周內(nèi)生長(zhǎng)速度較緩慢，但傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可用于藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg分泌曲線的繪制
　　目的：觀察HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情況。

4、
　　方法：HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)，在其貼壁后1～6d分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，－20℃保存，統(tǒng)一檢測(cè)。使用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg，顯色反應(yīng)后，酶標(biāo)儀讀取A450nm值，繪制分泌曲線。
　　結(jié)果：HepG2.2.15細(xì)胞在貼壁后1～6d，其培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg通過(guò)酶標(biāo)儀所測(cè)的A450nm值逐漸增大，分泌曲線呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)。
　　實(shí)驗(yàn)三：藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)<

5、br>　　目的：觀察不同濃度荔枝核總皂苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用。
　　方法：荔枝核總皂苷配制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625g/L共8個(gè)濃度梯度，拉米夫定配制成0.25g/L；HepG2.2.15細(xì)胞以1×107個(gè)/L接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后各藥物濃度組換入相應(yīng)濃度含藥培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組換入正常培養(yǎng)液。于加藥d6吸去上清液，每孔加5g/LMTT20μL，37℃

6、孵育4h，棄上清液后每孔加入DMSO150μL，震蕩10min，測(cè)A490nm值；通過(guò)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率和半數(shù)中毒濃度(TC50)。
　　結(jié)果：荔枝核總皂苷的0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625g/L組對(duì)細(xì)胞的抑制率分別為53.7％，39.3％，26.1％，12.7％，11.1％，8.2％，6.1％，4.2％，荔枝核總皂苷的TC50為0.67g/L；0.25g/L拉米夫定組對(duì)細(xì)胞的抑制

7、率為43.4％。在此實(shí)驗(yàn)中，0.025g/L荔枝核總皂苷組對(duì)細(xì)胞的抑制與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；0.4g/L荔枝核總皂苷組和0.25g/L拉米夫定組在細(xì)胞毒性上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)四：細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的測(cè)定
　　目的：觀察不同濃度荔枝核總皂苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的影響。
　　方法：使用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液

8、中的HBsAg和HBeAg，顯色反應(yīng)后，酶標(biāo)儀讀取A450nm值；通過(guò)公式計(jì)算抗原抑制率和50％藥物抑制濃度(IC50)。
　　結(jié)果：荔枝核總皂苷各濃度實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照組，其所測(cè)A450nm值均降低，且隨著藥物濃度的增加，培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降低愈明顯。0.025g/L荔枝核總皂苷組在d6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg和HBeAg與陰性對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而其他濃度組在d3，d6兩個(gè)時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBs

9、Ag和HBeAg分泌量均和陰性對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在d6，荔枝核總皂苷對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的IC50分別為0.096g/L和0.085g/L。
　　實(shí)驗(yàn)五：細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA的測(cè)定
　　目的：觀察不同濃度荔枝核總皂苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA的影響。
　　方法：按照TaqmanHBV核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。引物序列為P1：5’ATC

10、CTGCTGCTATGCCTCATCTT3’；P2：5’ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3’；熒光探針序列為：5’GGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3’。反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析出HBVDNA定量結(jié)果，計(jì)算HBVDNA抑制率和50％藥物抑制濃度(IC50)。
　　結(jié)果：荔枝核總皂苷各濃度實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照組，所測(cè)拷貝量均降低，且隨著藥物濃度的增加，培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降低愈明顯。0.025g/L荔枝核總皂

11、苷組在d6細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBVDNA含量與陰性對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而其他濃度組在d3，d6兩個(gè)時(shí)間段細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA的含量均和陰性對(duì)照組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在d6，荔枝核總皂苷對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA的IC50為0.128g/L。
　　結(jié)論：
　　1、HepG2.2.15細(xì)胞能向培養(yǎng)上清液中穩(wěn)定地分泌HBsAg和HBeAg，其分泌量隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加

12、。
　　2、荔枝核總皂苷對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性較小，TC50為0.67g/L，但隨著藥物濃度的提高，其毒性作用逐漸增加。
　　3、荔枝核總皂苷的不同濃度對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的分泌均有一定的抑制作用，且隨藥物濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制也隨之增強(qiáng)。
　　4、荔枝核總皂苷的不同濃度均能有效降低HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBVDNA含量，且隨藥物濃度的增加、作