銀杏葉提取物體外抗乙型肝炎病毒分泌抗原的作用.pdf

1、目的:
　　探討不同濃度的銀杏葉提取物(EGb761)對(duì)乙型肝炎病毒分泌抗原的作用，進(jìn)一步研究中藥在抗乙型肝炎病毒感染過(guò)程中的價(jià)值。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.用MTT法檢測(cè)銀杏葉提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性作用。
　　2.用不同濃度的銀杏葉提取物作用于HepG2.2.15細(xì)胞，期間分不同的時(shí)間段(4d和6d)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用時(shí)間分辨免疫熒光分析(TRFIA)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中乙肝

2、病毒表面抗原(HBsAg)及乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表達(dá)情況。用spss16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析EGb761對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌抗原的作用。
　　第二部分:用人乙型肝炎病毒(HBV)陽(yáng)性血清和銀杏葉提取物作用于HL-7702細(xì)胞株和樹鼩原代肝細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)（4d和6d）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞DNA，用TRFIA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBsAg;用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的HBV DN

3、A。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)顯示:分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天和第6天進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組吸光度值A(chǔ)(OD)與對(duì)照組吸光度值A(chǔ)(OD)，經(jīng)單因素方差分析沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后，第4天和第6天的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度 A值及HBeAg吸光度A值，明顯少于未加藥作用過(guò)的陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的乙肝病毒抗原吸光度

4、A值，經(jīng)單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761干預(yù)后，EGb761的濃度在55μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)，4d時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值小于6d時(shí)對(duì)應(yīng)藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg吸光度A值，4d時(shí)EGb761對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率大于6d時(shí)對(duì)應(yīng)藥物濃度對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制率;而EG

5、b761的濃度在219μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)，雖然4d時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值大于6d時(shí)對(duì)應(yīng)藥物濃度的細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBeAg吸光度A值，但是4d時(shí)EGb761對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率有大于6d時(shí)對(duì)應(yīng)藥物濃度對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制率。
　　4.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后，27μg/ml及以上的濃度范圍時(shí)測(cè)得的細(xì)胞

6、培養(yǎng)上清中的HBsAg吸光度A值與陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);219μg/ml及以上的濃度范圍時(shí)測(cè)得的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBeAg吸光度A值與陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度A值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　第二部分:
　　銀杏葉提取物干預(yù)過(guò)的感染了人HBV的HL-7702細(xì)胞株和樹鼩原代肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg呈陽(yáng)性，HL-7702細(xì)胞株培養(yǎng)上清中的HBsAg的吸光度A值在一倍稀釋濃度4d時(shí)與相應(yīng)

7、的陽(yáng)性對(duì)照組A值比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA經(jīng)PCR后灰度值沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化趨勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用EGb761的劑量在14μg/ml～1750μg/ml對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的毒性作用;
　　2.經(jīng)EGb761干預(yù)過(guò)4d和6d的HepG2.2.15細(xì)胞，EGb761的劑量濃度范圍在27μg/ml～1750μg/ml時(shí)對(duì)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBsA

8、g的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);而在219μg/ml～1750μg/ml的劑量范圍內(nèi)時(shí)對(duì)細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的HBeAg的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng);
　　3.HepG2.2.15細(xì)胞經(jīng)不同濃度的EGb761作用4d和6d后，EGb761在較低的濃度范圍內(nèi)就可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg;而抑制細(xì)胞分泌HBeAg到培養(yǎng)上清中卻需要較高的藥物濃度，并且EGb761對(duì)HBsAg的抑制率有強(qiáng)于對(duì)HBeAg的抑制率

9、的趨勢(shì)。
　　4.經(jīng)EGb761干預(yù)過(guò)的HepG2.2.15細(xì)胞，4d時(shí)對(duì)乙肝抗原的抑制率有強(qiáng)于6d時(shí)抑制率的趨勢(shì)。
　　5.EGb761的濃度在27μg/ml時(shí)可能是抑制HBsAg分泌的最低有效劑量濃度，同樣EGb761的濃度在219μg/ml時(shí)可能是抑制HBeAg分泌的最低有效劑量濃度。
　　6.HL-7702細(xì)胞株可能能夠被人HBV陽(yáng)性感染血清所感染，但是不能用其作為研究自然狀態(tài)下感染HBV的細(xì)胞模型。