JNK在化學(xué)治療藥物與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中的作用及耐藥逆轉(zhuǎn).pdf

1、目前，惡性腫瘤的治療主要采取手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療及生物治療等綜合性治療措施?；瘜W(xué)藥物治療在卵巢癌的臨床治療中占有重要地位，它能使癌灶縮小，并能消除術(shù)后散在的癌組織，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。但是，由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致化學(xué)藥物治療的失敗。因此，對(duì)耐藥產(chǎn)生機(jī)制的研究及如何逆轉(zhuǎn)耐藥是當(dāng)前腫瘤治療研究工作的重點(diǎn)。順鉑和阿霉素是臨床上治療惡性腫瘤常用的化學(xué)治療藥物，耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了其治療效果。細(xì)胞功能的正常運(yùn)行是凋亡與存活

2、信號(hào)之間平衡的結(jié)果，存活信號(hào)增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞的特性之一，本研究主要通過(guò)卵巢癌順鉑耐藥模型和乳腺癌阿霉素耐藥模型，在體外探討耐藥產(chǎn)生的機(jī)理、及如何從基因水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)是調(diào)控真核細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，通過(guò)磷酸化不同特異性底物而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能，參與了細(xì)胞對(duì)外界刺激的多種反應(yīng)，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活和死亡。轉(zhuǎn)錄因子是M

3、APK的重要作用目標(biāo)，其主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。c-Jun氨基末端激酶(c-JunNH2-terminalkinase，JNK)屬M(fèi)APK亞族成員之一，為跨核膜蛋白激酶，細(xì)胞外刺激可通過(guò)激活Ras、RhoGTP酶通路激活MAPKKKs，使MAPKK4和7磷酸化，JNK(Thr183/Tyrl85)激酶依次被激活。活化的JNK激活轉(zhuǎn)錄因子c-Jun(Ser63/Ser73)，c-Jun結(jié)合到AP-1元件啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。其主要作用是

4、參與各種壓力刺激，包括腫瘤壞死因子，紫外線等，引起的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。研究表明，泰素可通過(guò)激活JNK誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，JNK信號(hào)系統(tǒng)是否參與順鉑、阿霉素等化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及其激活與否是否與腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的耐受性有關(guān)，目前尚無(wú)人研究。 腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)家族

5、成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可迅速誘導(dǎo)乳腺癌，直腸癌，肺癌，和前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用。TRAIL是否可誘導(dǎo)對(duì)化學(xué)治療藥物耐藥的腫瘤細(xì)胞凋亡、其與化學(xué)治療藥物聯(lián)合應(yīng)用是否可增強(qiáng)化學(xué)治療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制如何，是否可使腫瘤細(xì)胞的耐藥性得到逆轉(zhuǎn)，TRAIL與JNK通路之間的聯(lián)系如何，目前尚無(wú)研究。 本研究就以上問(wèn)題進(jìn)行探討并研究TRAIL與JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的聯(lián)系及逆轉(zhuǎn)耐藥的可行性

6、。 1.通過(guò)比較人卵巢癌細(xì)胞敏感株A2780及耐藥株A2780/DDP順鉑作用后JNK活性的變化、細(xì)胞的凋亡情況，明確阻斷JNK(c-JunNH2-terminalkinase)活化在順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡中的作用，及以野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的MSCV-IRES-JNK1-GFP(JNK-wt)基因轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)。將含有JNK顯性突變體的質(zhì)粒pcDNA3(FLAG)-JNK-dn轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，全長(zhǎng)野生型JNK1的逆

7、轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體MSCV-IRES-JNK1-GFP和逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體質(zhì)粒MSCV-IRES-GFP分別導(dǎo)入BOSC-23細(xì)胞中，以病毒上清感染A2780/DDP細(xì)胞中。采用免疫印跡，免疫熒光顯微鏡，觀察順鉑作用后卵巢癌細(xì)胞A2780和A2780/DDP中p-JNK、及下游p-c-Jun的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的凋亡情況。RT-PCR檢測(cè)Fas/FasL的表達(dá)。20μMDDP作用后A2780細(xì)胞p-JNK、及下游p-c

8、-Jun持續(xù)表達(dá)，而A2780/DDP細(xì)胞僅有短暫表達(dá)。JNK-dn基因轉(zhuǎn)染可抑制順鉑誘導(dǎo)的JNK的活性，阻斷順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。JNK1-wt基因轉(zhuǎn)染可使JNK持續(xù)活化，使下游的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化，使Fas/FasL上調(diào)，細(xì)胞凋亡率著增加。我們的研究表明，JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡中起重要作用。JNK活化時(shí)間是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。野生型JNK1基因能逆轉(zhuǎn)A2780/DDP細(xì)胞的耐藥性。 2.研究腫瘤壞死

9、因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL/APO-2L)在體外表達(dá)及其殺傷腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，探討重組的TRAIL用于腫瘤基因治療的應(yīng)用前景，及其與化學(xué)治療藥物聯(lián)合應(yīng)用持續(xù)激活JNK通路從而逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)理。我們通過(guò)構(gòu)建TRAIL全長(zhǎng)序列的pcDNA3表達(dá)載體pcDNA3-TRAIL，轉(zhuǎn)染人卵巢癌OVCAR3，宮頸癌Hela和乳腺癌MCF-7/ADM等細(xì)胞株，以免疫印記

10、法測(cè)蛋白的表達(dá)，MTT法測(cè)定pcDNA3-TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果，成功獲得了pcDNA3-TRAIL的表達(dá)載體，并可顯著誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的凋亡。表達(dá)pcDNA3-TRAIL的Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性得到逆轉(zhuǎn)，其IC50由35μM降至16.5μM。阿霉素對(duì)MCF-7、MCF-7/ADM和TRAIL-MCF-7/ADM細(xì)胞的IC50分別為0.65、52和12.7μM。MCF-7/ADM細(xì)胞的