重組人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體的表達、分離純化及其生物活性研究.pdf

1、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand，Apo2L)，是1995年發(fā)現(xiàn)的TNF家族新成員。無論在體內(nèi)還是體外，可溶形式TRAIL均可誘導多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡。人全長的TRAIL分子由281個氨基酸組成，屬Ⅱ型跨膜蛋白，包括胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和胞膜外區(qū)，分子量為32.5kD，等電點為7.63。TRAIL分子在第114位～

2、281位氨基酸為可溶性肽段，可通過一個鋅離子形成活性最強的同源三聚體結構。 TRAIL是通過與其細胞膜受體結合發(fā)揮其誘導凋亡作用的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種：TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1)、TRAIL-R4(DcR2)和護骨素(osteoprotegerin，OPG)。TRAIL與死亡受體結合可以激活線粒體依賴和非線粒體依賴兩條細胞凋亡信號途徑，介導死亡信號轉導入

3、細胞內(nèi)，啟動效應酶胱天蛋白酶3(caspase-3)，最終引起腫瘤細胞凋亡。與TNF家族其它成員相比，TRAIL具有可選擇性誘導多種腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞毒副作用小的優(yōu)點，被認為是一種具有廣闊發(fā)展前景的抗腫瘤藥物，從2000年以來，一直受到國內(nèi)許多研究者的廣泛關注。 最近，本實驗室利用pET-23d(+)質粒做為表達載體，構建了表達TRAIL<,114-281>蛋白的原核表達載體。本實驗利用以上表達載體，對TRAIL<,11

4、4-281>蛋白的表達、純化及抗腫瘤活性等方面進行了研究。我們選擇大腸桿菌w3110做為目標蛋白表達的宿主菌，利用常規(guī)方法用我室構建的原核表達載體pET-23d(+)/TRAIL<,114～281>轉化E.coli w3110感受態(tài)細胞，經(jīng)質粒擴增、提取后，酶切鑒定轉化結果。為了使目標蛋白在宿主菌中獲得高效表達，我們在搖瓶條件下進行了培養(yǎng)基成分(包括培養(yǎng)基類型、碳源、氮源成分和重要金屬離子)的優(yōu)化。SDS-PAGE結果顯示，最終確定的發(fā)

5、酵條件可使TRAIL蛋白得到高效表達，表達量占菌體總蛋白的50％，可溶形式占上清20％左右，產(chǎn)量約75mg/L。可溶部分先后通過兩步離子交換層析純化后，純品蛋白利用RP-HPLC檢測純度達到96％。利用MTT法初步檢測純化蛋白的體外抗腫瘤活性，選擇SMMC7721、K562、A549和KB<,v200>四種腫瘤細胞系，考察重組TRAIL蛋白對這些細胞的生長抑制作用。結果發(fā)現(xiàn)，在相同的劑量范圍內(nèi)，重組目標蛋白對SMMC7721、K562、