人腫瘤壞死因子樣弱凋亡因子的克隆、表達及功能研究.pdf

1、目的:(1)從中國人組織細胞中克隆TWEAK cDNA的全長序列和可溶性胞外區(qū)編碼基因sTWEAK1和sTWEAK2(sTWEAK1為TWEAK的150~767bp,而sTWEAK2為TWEAK的144~767bp);(2)將TWEAK胞外區(qū)編碼基因在大腸桿菌中進行融合表達,并對表達產(chǎn)物進行初步純化;(3)研究融合蛋白的細胞凋亡作用及其可能的作用機制;(4)構建TWEAK腺病毒表達載體,在HEK293細胞中進行表達,并評價TWEAK基因

2、治療惡性腫瘤的可能性.方法:(1)該研究用RT-PCR方法,從人組織細胞總RNA中擴增可溶懷TWEAK胞外區(qū)(sTWEAK1和sTWEAK2)的cDNA序列及全長編碼序列,用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物,膠回收目的基因片段,連接到pMD18-T克隆載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌K802,PCR和酶切篩選陽性克隆,全自動DNA測序驗證序列;(2)sTWEAK1和sTWEAK2分別亞克隆到pProEx HTb和pMAL-C2x表達載體中,分別轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌BL21和TB1,PCR篩選和酶切鑒定,陽性克隆用IPTG誘導表達,表達產(chǎn)物用SDS-PAGE分析和Western blot驗證融合蛋白;(3)用NTA-Ni Spin試劑盒初步分離純化sTWEAK1融合蛋白;(4)用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞和正常對表達產(chǎn)物進行活性檢測,貼壁細胞用結晶紫染色法,懸浮細胞用磺酰羅丹明B染色法,酶標儀檢測OD值;(5)敏感細胞用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-8的含量;(6)用光鏡和電鏡觀察敏感細胞死亡和

4、細胞凋亡情況;(7)用流式細胞儀分析表達產(chǎn)物對敏感細胞凋亡率和細胞周期的影響;(8)用雙熒光素酶報告基因檢測法,測定表達產(chǎn)物對敏感細胞NF-κB的影響;(9)用pShuttle穿梭質(zhì)粒TWEAK重組到腺病毒載體上,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細胞,PCR鑒定重組質(zhì)粒.結論:(1)TWEAK胞外區(qū)在大腸桿菌中獲得較高的可溶性融合表達;(2)TWEAK胞外區(qū)融合蛋白具有明顯的生物學活性.可誘導多種腫瘤細胞凋亡.刺激敏感細胞IL-8分泌增多