獼猴川西亞種腫瘤壞死因子α基因的克隆及表達(dá).pdf

1、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一種強(qiáng)效的細(xì)胞因子,在參與免疫反應(yīng)、炎癥、損傷反應(yīng)、控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡均能發(fā)揮作用。TNF-α及其抑制劑對于多種疾病的早期診斷、預(yù)后判斷和治療方面都有重要作用。獼猴川西亞種已用于多種人類重大疾病非人靈長類模型的構(gòu)建，是研究TNF-α生物制劑對多種痰病影響的高價(jià)值實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。到目前為止，TNF-α在人和其他動(dòng)物方面研究較多，但對獼猴TNF-

2、α的研究較少，國內(nèi)還未見獼猴川西亞種（Macaca mulatta lasiotis，Mm）TNF-α克隆表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。本研究通過基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α，并構(gòu)建MmTNF-α基因的原核和真核表達(dá)菌株，并進(jìn)行表達(dá)，為深入研究MmTNF-α蛋白活性功能、結(jié)構(gòu)功能、制備單克隆抗體、開發(fā)檢測試劑盒奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，也為保護(hù)獼猴川西亞種提供資料。
　　1、獼猴川西亞種TNF-α基因的克隆與原核表達(dá)
　　參照NCBI/GenBan

3、k上登錄的獼猴TNF-α mRNA序列設(shè)計(jì)一對引物，利用基因克隆技術(shù)獲得MmTNF-α全長轉(zhuǎn)錄本為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，將其定向插入pMD-19T上，構(gòu)建重組菌DH5α/pMD-19T-MmTNF-α，隨機(jī)挑取陽性重組子進(jìn)行PCR鑒定及序列測定分析。擴(kuò)增獲得的MmTNF-α基因?yàn)?02 bp，測序結(jié)果和GenBank上發(fā)布的獼猴TNF-α序列(NCBI Reference Sequence: NM_001047149.1)比對，同源

4、性為99％。
　　根據(jù)測序成功的MmTNF-α基因序列設(shè)計(jì)合成一對表達(dá)引物，經(jīng)亞克隆構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-MmTNF-α，進(jìn)行PCR、雙酶切鑒定，并在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。在37℃下，0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)原核表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-MmTNF-α4 h，獲得大小約為52 kDa且主要以包涵體形式存在的融合蛋白，與預(yù)期大小一致，經(jīng)過WB分析證實(shí)重組

5、蛋白具有良好免疫反應(yīng)性。
　　2、獼猴川西亞種TNF-α真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　將實(shí)驗(yàn)室克隆的MmTNF-α基因插入pPIC9K多克隆位點(diǎn)，Sal I線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-MmTNF-α，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化GS115。PCR鑒定陽性克隆，用PCR、MM和MD平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子表型鑒定，G418梯度平板篩選高拷貝重組菌。重組菌pPIC9K-MmTNF-α/GS115利用甲醇誘導(dǎo)，SDS-PAGE和Western-blot分析表