黑鯛腫瘤壞死因子cDNA的克隆與體外表達(dá)的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子(TNFα)是一種具有廣譜生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,在不影響正常細(xì)胞的前提下,于體內(nèi)外均能殺傷腫瘤細(xì)胞并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖;并且可以通過(guò)刺激T細(xì)胞,誘導(dǎo)MHC的表達(dá),參與和調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥及發(fā)熱反應(yīng)[Camussi,1991].該研究采用同源克隆的方法,從黑鯛cDNA中獲得腫瘤壞死因子(TNFα)全長(zhǎng)cDNA序列.該序列含1288核苷酸,可編碼253個(gè)氨基酸的TNF前體蛋白.它是一種跨膜蛋白,無(wú)糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu).黑

2、鯛TNFα與其它魚類的TNFα的相似性很高,與其它魚類TNFα占據(jù)進(jìn)化上獨(dú)立的分支,與哺乳類TNFα和TNFβ源于共同的祖先.基因結(jié)構(gòu)分析顯示,該基因含有TNF家族profile和TNF家族的標(biāo)簽序列;在參與TNFα基因二硫鍵形成的兩個(gè)半胱氨酸和TNFα三聚體形成的位點(diǎn)高度保守;空間結(jié)構(gòu)模擬顯示,它與哺乳類TNFα的空間結(jié)構(gòu)相似,都是由兩個(gè)β折疊片組成,每個(gè)折疊片包含五個(gè)反向平行的β鏈.表達(dá)研究結(jié)果表明,黑鯛TNFα在檢測(cè)的各個(gè)組織中均

3、為組成型表達(dá),表現(xiàn)為在刺激與非刺激魚體中,都可以檢測(cè)到黑鯛TNFα的表達(dá),但是其表達(dá)水平在不同組織中有很大差異.黑鯛TNFα在頭腎、脾臟和鰓的表達(dá)量較高,而在心臟、肝臟、血液、腎臟和大腦中表達(dá)量較低.為進(jìn)一步研究黑鯛腫瘤壞死因子的生物學(xué)功能,將黑鯛腫瘤壞死因子(TNFα)基因的成熟肽區(qū)域亞克隆到表達(dá)載體pQE30中,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-blue中進(jìn)行表達(dá).轉(zhuǎn)化子經(jīng)載體和基因特異性引物進(jìn)行PCR雙向篩選,并將篩選到的陽(yáng)性克隆經(jīng)質(zhì)粒純化

4、后,進(jìn)行序列測(cè)定.序列測(cè)定結(jié)果顯示,該基因結(jié)構(gòu)正確,且準(zhǔn)確地插入到表達(dá)載體啟動(dòng)子的下游,獲得了結(jié)構(gòu)和組成正確的重組子.重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,以SDS-PAGE電泳鑒定,電泳結(jié)果表明,該基因在大腸桿菌XL1-blue中實(shí)現(xiàn)了表達(dá).不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白影響實(shí)驗(yàn)顯示,隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加,重組蛋白產(chǎn)量逐漸增高,經(jīng)4h誘導(dǎo),其表達(dá)量可以達(dá)到平臺(tái)期,繼續(xù)培養(yǎng),rTNFα的表達(dá)并不顯著增高.重組蛋白經(jīng)鎳金屬親和層析純化,獲得了純度較高的重組蛋白.采