沉默腫瘤壞死因子α基因抑制β淀粉樣肽神經(jīng)毒性實驗研究.pdf

1、目的:
　　運用RNA干擾技術沉默大鼠小膠質(zhì)細胞的TNF-α基因，觀察小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α的功能是否得到抑制，以及β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)對海馬神經(jīng)元的促凋亡作用是否得到改善，探討小膠質(zhì)細胞源性炎性反應在AD發(fā)病中的可能作用途徑和機制，以期為阿爾茨海默?。ˋD）基因水平上的抗炎治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　構建針對TNF-α編碼區(qū)表達小干擾RNA(siRNA)的載體，然后轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細胞使之轉(zhuǎn)錄si

2、RNA，再以Aβ1-42刺激，得到的條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，用western blot法檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的表達水平，用TUNEL法和DNA Ladder凝膠電泳法觀察海馬神經(jīng)元的凋亡情況，同時用激酶活性測定法測定凋亡相關蛋白casepase-3的激活程度，并進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　針對SD大鼠TNF-α mRNA編碼區(qū)基因序列的4

3、個不同位點，成功構建了小干擾RNA(siRNA)的表達載體pGPU6/EGFP/Neo-shRNA:PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-500,GPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-535,PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-564，PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153及陰性對照(shNC)。以LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑將構建的4個載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細胞，wester

4、n blot證明PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153的RNA干擾效率最高。western blot法進行檢測神經(jīng)元內(nèi)iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的水平，可觀察到轉(zhuǎn)染組iNOS及硝基酪氨酸的表達量比對照組明顯降低。TUNEL和DNA電泳鑒定神經(jīng)元細胞凋亡程度，轉(zhuǎn)染組比對照組明顯減輕。
　　結論:
　　1.采用“營養(yǎng)缺失法”，并結合“搖床分離法”能夠獲得高純度的小膠質(zhì)細胞;
　　2.采

5、用無血清培養(yǎng)法能夠獲得高純度的海馬神經(jīng)元細胞;
　　3.Aβ1-42能激活原代小膠質(zhì)細胞并促進其分泌TNF-α蛋白;
　　4.激活后的小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，能誘導海馬神經(jīng)元凋亡及促進神經(jīng)元內(nèi)iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的表達水平增高;
　　5.表達載體PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153對TNF-α的表達具有RNA干擾效應;
　　6.通過RNA干擾技