沉默腫瘤壞死因子α基因抑制β淀粉樣肽神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　運(yùn)用RNA干擾技術(shù)沉默大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的TNF-α基因，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α的功能是否得到抑制，以及β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)對(duì)海馬神經(jīng)元的促凋亡作用是否得到改善，探討小膠質(zhì)細(xì)胞源性炎性反應(yīng)在AD發(fā)病中的可能作用途徑和機(jī)制，以期為阿爾茨海默?。ˋD）基因水平上的抗炎治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　構(gòu)建針對(duì)TNF-α編碼區(qū)表達(dá)小干擾RNA(siRNA)的載體，然后轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞使之轉(zhuǎn)錄si

2、RNA，再以Aβ1-42刺激，得到的條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，用western blot法檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的表達(dá)水平，用TUNEL法和DNA Ladder凝膠電泳法觀察海馬神經(jīng)元的凋亡情況，同時(shí)用激酶活性測定法測定凋亡相關(guān)蛋白casepase-3的激活程度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　針對(duì)SD大鼠TNF-α mRNA編碼區(qū)基因序列的4

3、個(gè)不同位點(diǎn)，成功構(gòu)建了小干擾RNA(siRNA)的表達(dá)載體pGPU6/EGFP/Neo-shRNA:PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-500,GPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-535,PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-564，PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153及陰性對(duì)照(shNC)。以LipofectamineTM2000作為轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建的4個(gè)載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細(xì)胞，wester

4、n blot證明PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153的RNA干擾效率最高。western blot法進(jìn)行檢測神經(jīng)元內(nèi)iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的水平，可觀察到轉(zhuǎn)染組iNOS及硝基酪氨酸的表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低。TUNEL和DNA電泳鑒定神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程度，轉(zhuǎn)染組比對(duì)照組明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.采用“營養(yǎng)缺失法”，并結(jié)合“搖床分離法”能夠獲得高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞;
　　2.采

5、用無血清培養(yǎng)法能夠獲得高純度的海馬神經(jīng)元細(xì)胞;
　　3.Aβ1-42能激活原代小膠質(zhì)細(xì)胞并促進(jìn)其分泌TNF-α蛋白;
　　4.激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)iNOS和硝基酪氨酸(nitrotyrosine)的表達(dá)水平增高;
　　5.表達(dá)載體PGPU6/EGFP/Neo-tnf-rat-153對(duì)TNF-α的表達(dá)具有RNA干擾效應(yīng);
　　6.通過RNA干擾技