腫瘤壞死因子基因多態(tài)性Graves病相關(guān)性研究.pdf

1、Graves病(GD)是一種常見(jiàn)的自身免疫性內(nèi)分泌疾病，其確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，因而缺乏有效的病因治療方法。自身免疫是一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其發(fā)生發(fā)展有賴(lài)于遺傳因素與環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能的免疫介質(zhì)，目前研究證明多種細(xì)胞因子如干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、腫瘤壞死因子(TNF)等通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用

2、及改變甲狀腺細(xì)胞與免疫細(xì)胞的功能參與了GD的發(fā)生與發(fā)展，TNFα是一種重要的細(xì)胞因子，多種研究證明TNFα在GD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作：應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)及免疫組化方法可在GD患者的甲狀腺及眼球后組織中檢測(cè)到TNFα及其mRNA表達(dá)；TNFα可使GD患者的甲狀腺細(xì)胞、眼球后脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ類(lèi)分子、粘附分子、趨化因子及一些細(xì)胞因子表達(dá)增加，從而使免疫反應(yīng)得以維持與加強(qiáng)；TNFα抑制鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

3、白(NIS)mRNA表達(dá)與蛋白質(zhì)合成，從而抑制甲狀腺吸碘并抑制甲狀腺細(xì)胞合成與分泌三碘甲狀腺原氨酸(T3)及四碘甲狀腺原氨酸(T4)；TNFα還通過(guò)影響FasL/Fas、sFas等表達(dá)而影響甲狀腺細(xì)胞凋亡。人類(lèi)TNFα基因存在著-308、-238、-276、-163、-857、-863、-1031、+70、+488等多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄的研究證明TNFα多態(tài)性可通過(guò)影響TNFα基因的轉(zhuǎn)錄而影響TNFα的產(chǎn)量，從而影響對(duì)疾病的易感

4、性。已有研究證明+488多態(tài)性位點(diǎn)與普通變異免疫缺陷病相關(guān)，-308多態(tài)性位點(diǎn)與多種自身免疫性疾病相關(guān)且有種族差異。 目的： 目前TNFα基因多態(tài)性與GD易感性的關(guān)系尚不肯定，該研究采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR-SSP)對(duì)TNFα+488、-308基因多態(tài)性與山東漢族GD易感性的關(guān)系進(jìn)行探討。 對(duì)象與方法： 一、對(duì)象 (1)GD組：參照《內(nèi)科學(xué)》第五版和《協(xié)和內(nèi)分泌代謝學(xué)》中GD的診

5、斷標(biāo)準(zhǔn)確定GD的入選條件為：1)存在甲狀腺功能亢進(jìn)癥狀，伴或不伴突眼，觸診甲狀腺?gòu)浡阅[大、甲狀腺功能檢查(時(shí)間分辨免疫熒光法)：游離T3(FT3)、游離T4(FT4)水平升高、高敏促甲狀腺激素(sensivethyroidstimulatinghormone,sTSH)水平降低；2)已確診為GD，經(jīng)治療后緩解(中、小劑量抗甲狀腺藥物短期內(nèi)即出現(xiàn)甲狀腺功能減退者除外)或未緩解。符合上述條件之一者入選。根據(jù)1977年美國(guó)甲狀腺協(xié)會(huì)推薦的標(biāo)

6、準(zhǔn)將甲狀腺相關(guān)眼病(TAO)分為Ⅵ級(jí)，大于等于Ⅰ級(jí)確診為T(mén)AO。對(duì)于入選者再根據(jù)性別、有無(wú)GD家族史、有無(wú)TAO分為三個(gè)亞組。 (2)對(duì)照組：健康對(duì)照入選條件為：1)年齡12歲～75歲；2)無(wú)GD、橋本氏甲狀腺炎(HT)等甲狀腺疾病及家族史。3)無(wú)其他自身免疫性疾病及家族史。選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院無(wú)血緣關(guān)系的山東漢族患者及健康體檢者各100例。 二、方法 1、基因組DNA提取：抽取空腹血2ml，ACD液防凝，用DN

7、A快速提取試劑盒(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室提供)提取外周血白細(xì)胞DNA。 2、PCR-SSP技術(shù)擴(kuò)增目的DNA片段：參照Fanning的方法進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)參照國(guó)外文獻(xiàn)由上海生物工程有限公司合成。針對(duì)TNFα+488多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的兩條3’末端序列特異性引物為+488g：5’-gCATCCCCgTCTTTCTCCAC，+488a：5’-gCATCCCCgTCTTTCTCCAT；針對(duì)TNFα-308多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)的兩條3’末端序列

8、特異性引物為-308g：5’-ATAggTTTTgAggggCATCg，-308a：5’-ATAggTTTTgAggggCATCA；針對(duì)人生長(zhǎng)激素內(nèi)參照DNA擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)的兩條上下游引物為5’-gCCTTCCCAACCATTCCCTT，5’-TCACggATTTCTgTTgTgTTTC?？偡磻?yīng)體積50μl，含10×buffer5μl，25mmol/LMgCL24μl，10mmol/LdNTP1μl，TaqDNA聚合酶2.0u，DNA模板

9、3μl(約200ng)，25mmol/LTNFα目的DNA擴(kuò)增片段上下游引物各1μl，25mmol/L人生長(zhǎng)激素內(nèi)參照DNA擴(kuò)增片段上下游引物各1μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃2min；94℃1min，55℃45s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR反應(yīng)在MJResearchMinicycleTM熱循環(huán)儀上完成，PCR試劑由上海生物工程有限公司提供。 3、基因型確定：PCR產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色，與DNA分子

10、量標(biāo)記物一起于1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線透射燈下確定等位基因及基因型。DNA分子量標(biāo)記物由大連寶生物公司提供。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 兩組等位基因及基因型分布頻率經(jīng)Hard-Weinberg平衡試驗(yàn)檢驗(yàn)其是否具有群體代表性，兩組間及亞組間計(jì)數(shù)資料的比較經(jīng)卡方檢驗(yàn)。 四、結(jié)果： (一)PCR電泳結(jié)果：基因組DNA用以擴(kuò)增TNFα+488、-308之間的目的DNA片段及人生長(zhǎng)激素內(nèi)參照DNA片段。TNFα+

11、488、-308每一位點(diǎn)的兩條序列特異性引物分別作為目的DNA片段的上游及下游引物不同組合，每一個(gè)DNA標(biāo)本有4種目的DNA片段PCR擴(kuò)增體系：+488g→-308g、+488g→-308a、+488a→-308g及+488a→-308a。為證明擴(kuò)增反應(yīng)成功，每種PCR混合反應(yīng)體系內(nèi)均含有人生長(zhǎng)激素內(nèi)參照引物。只有內(nèi)參照DNA片段擴(kuò)增成功，才說(shuō)明PCR擴(kuò)增反應(yīng)是成功的，以避免由于PCR混合反應(yīng)體系本身有問(wèn)題造成的目的DNA片段擴(kuò)增假陰性

12、。每一種PCR混合反應(yīng)體系反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外線透射燈下觀察，在450bp處均出現(xiàn)一條人生長(zhǎng)激素內(nèi)參照DNA擴(kuò)增條帶，根據(jù)序列特異性引物能否與靶DNA結(jié)合，在835bp處可出現(xiàn)一條或不出現(xiàn)TNFα目的DNA擴(kuò)增條帶。再根據(jù)目的DNA條帶出現(xiàn)的PCR反應(yīng)體系的種類(lèi)確定TNFα+488與-308位點(diǎn)的等位基因及基因型。 (二)Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)：根據(jù)等位基因頻率計(jì)算基因型頻率預(yù)期值，用卡方檢驗(yàn)基因型頻率

13、實(shí)測(cè)值與預(yù)期值之間有無(wú)顯著性差異，結(jié)果基因型頻率實(shí)測(cè)值與預(yù)期值之間無(wú)顯著性差異，符合Hard-Weinberg遺傳平衡規(guī)律。 (三)GD組與對(duì)照組之間TNFα+488、-308等位基因及基因型頻率分布比較無(wú)顯著性差異。 (四)不同性別、有無(wú)GD家族史、有無(wú)TAOGD之間TNFα+488、-308等位基因及基因型頻率分布比較無(wú)顯著性差異(表3)。 (五)不同嚴(yán)重程度的TAO之間TNFα+488，-308等位基因及基

14、因型頻率分布比較無(wú)顯著性差異。 五、結(jié)論： (1)山東漢族健康人群中存在TNFα+488、-308G/A基因多態(tài)性，A等位基因在健康人群中的分布頻率分別為12％與20％左右。 (2)TNFα+488、-308基因多態(tài)性與山東漢族GD發(fā)病無(wú)關(guān)聯(lián)。 (3)TNFα+488、-308基因多態(tài)性與不同性別GD無(wú)關(guān)聯(lián)。 (4)TNFα+488、-308基因多態(tài)性與有無(wú)GD家族史無(wú)關(guān)聯(lián)。 (5)TNF