腫瘤壞死因子及其基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的相關(guān)性研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(multipie sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病，有遺傳易感性?，F(xiàn)普遍認(rèn)為MS是一種遺傳易感個(gè)體在某些環(huán)境因素影響下通過變態(tài)反應(yīng)性免疫障礙而引發(fā)的多病因疾病。近年研究提示，MS兩種亞型——西方型和亞洲型不僅臨床特征不同，其免疫遺傳背景也存在著顯著差異。 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)包括TNFa和TNFβ，是一種參與免疫應(yīng)答的細(xì)

2、胞因子，分別主要來源于激活的單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，兩者具有相似的生物學(xué)活性，具有廣泛的誘導(dǎo)炎癥和調(diào)節(jié)免疫的功能，而編碼TNF的基因具有多態(tài)性。TNF基因位于人類6號染色體短臂上，HLA-Ⅲ類基因區(qū)內(nèi)，分別編碼TNFa和TNFβ，并與某些HLA單倍體基因緊密連鎖。有研究表明TNF水平在MS急性期增高并隨病情好轉(zhuǎn)下降；動物實(shí)驗(yàn)和病理研究均證實(shí)TNF與髓鞘脫失、軸索變性有關(guān)。由于TNF的重要免疫學(xué)作用及其基因的特殊位置，有必要從分子水平探討

3、其在MS發(fā)病中的作用，我們對TNFa和TNFβ的基因多態(tài)性狀況及其與MS兩種亞型不同病期發(fā)病的關(guān)系作了以下探討。 目的：1．研究MS兩種亞型——西方型和亞洲型的易感性與TNFa和TNFβ基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)，從免疫遺傳學(xué)角度探討自身內(nèi)在因素在MS發(fā)病中的作用。 2．研究兩型MS患者不同病期TNFa和TNFβ水平的變化，探討TNFa和TNFβ在MS發(fā)病中的作用。3．探討MS患者TNFa和TNFβ基因多態(tài)性與EDSS評分、病程及發(fā)病次

4、數(shù)等臨床資料之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討基因多態(tài)性在MS發(fā)病中的作用。 4．分析EDSS評分與TNF水平、病程、發(fā)病次數(shù)及首次發(fā)病年齡之間的相關(guān)性。 5．分析兩型MS患者之間在EDSS評分、首次發(fā)病年齡、性別、病程及發(fā)病次數(shù)方面有無差別。 方法：1．病例組：選擇58例MS患者，均符合1983年P(guān)oser等的診斷標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)1996年Kira等的方法將MS分為西方型和亞洲型兩個(gè)亞型，其中西方型MS組22例，亞洲型MS組36例；再根據(jù)病程

5、和病情分為急性期MS組37例和緩解期MS組21例。對照組：選擇79例無血緣關(guān)系的健康人，年齡、性別均與病例組匹配，近期無感染、未應(yīng)用免疫抑制劑。 2．抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血，并用EDTA抗凝，在三天之內(nèi)以改良快速鹽析法自血中抽提基因組DNA。 3．采用聚合酶鏈(PCR)方法進(jìn)行TNFa和TNFβ目的基因片段擴(kuò)增，擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果參照Marker標(biāo)準(zhǔn)判斷。 4．采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法進(jìn)行TNFa和T

6、NFβ基因多態(tài)性分析，在含有0.5％溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳，并應(yīng)用凝膠圖像分析儀觀察帶型，進(jìn)行等位基因分型。 5．從血液標(biāo)本中分離血清，-70℃凍存，避免反復(fù)凍溶。應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測定血清中TNFa和TNFβ水平。 6．對MS組患者分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的EDSS(an expandeddisability status scale，EDSS)評分、首次發(fā)病年齡、病程、發(fā)病次數(shù)等臨床資料收集。 7．應(yīng)用SA

7、S 6.12統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對照組和病例組基因型的分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，有群體代表性。TNF基因型、等位基因數(shù)、性別用直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，并計(jì)算各等位基因頻率，組間比較采用x<'2>檢驗(yàn)。用Woolf公式計(jì)算相對風(fēng)險(xiǎn)度(relativerisk，RR)大小。TNF水平、EDSS評分、年齡、病程及發(fā)病次數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較用f檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，必要時(shí)行多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較

8、的SNK-q檢驗(yàn)。采用相關(guān)和逐步多元回歸檢驗(yàn)EDSS評分與TNFβ水平、年齡、病程及發(fā)病次數(shù)間的相關(guān)性。顯著檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為P<0.05。 結(jié)果： 1．MS組、西方型MS組、亞洲型MS組TNFa基因型分布及等位基因頻率分別與正常對照組比較均無明顯差異(P>0.05)。 2．MS組TNFβ基因型分布與對照組相比有明顯差異(P<0.05)；MS組TNFβ1等位基因頻率(45.69％)顯著高于健康對照組(27.85％)， (P<0.05，

9、RR=2.18)。亞洲型MS組YNFβ基因型分布與對照組相比有明顯差異(P<0.05)；亞洲型MS組TNFβ1等位基因頻率(51.39％)顯著高于健康對照組(27.85％)， (P<0.05，RR=2.74)。而西方型MS組TNFβ基因型分布和等位基因頻率與對照組相比均無明顯差異(P>0.05)。 3．MS組TNFa各基因型組的EDSS評分、首次發(fā)病年齡、病程、發(fā)病次數(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4．MS組、西方型MS

10、組、亞洲型MS組TNFβ各基因型組的EDSS評分、首次發(fā)病年齡、病程、發(fā)病次數(shù)分別進(jìn)行組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5．(1)急性期MS組TNFa水平為(26.89±14.65)pg/mL,TNFβ水平為(607.92±289.13)pg/mL，均較健康對照組明顯升高(P<0.05)。(2)緩解期MS組TNFa、TNFβ水平與健康對照組比較均無顯著差異(P>0.05)。而緩解期西方型MS組TNFa水平為(19.87±17

11、.97)pg/mL與正常對照組比較有顯著差異(P<0.05)。 (3)急性期MS組TNFa、TNFβ水平均較緩解期MS組明顯升高(P<0.05)。而西方型急性期MS組TNFa水平與西方型緩解期MS組比較無顯著差異(P>0.05)，且亞洲型急性期MS組TNFβ水平與亞洲型緩解期MS組比較亦無顯著差異(P>0.05)。 6．EDSS評分與病程、發(fā)病次數(shù)及首次發(fā)病年齡均呈正相關(guān)(P<0.05)。 7．兩亞型在EDSS評分、首次發(fā)病年齡、性別、

12、病程、發(fā)病次數(shù)諸方面均無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．TNFβ1等位基因頻率在MS患者中明顯增高，說明該等位基因與MS的易感性相關(guān)。攜帶有TNFβ1等位基因的個(gè)體可能更易感染亞洲型MS。 2．TNFa基因多態(tài)性可能與MS遺傳易感性不相關(guān)。 3．TNFa和TNFβ血清水平在MS急性期升高，并且隨著病情的緩解而逐漸恢復(fù)正常，說明TNF在MS發(fā)病過程中起促進(jìn)作用，而且可能TNFa和TNFβ分別在亞洲型MS和西方型MS發(fā)病過