新合成靛玉紅類化合物的抗腫瘤作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:從一系列新合成的化合物中篩選出能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的靛玉紅類化合物，探討其可能的抗腫瘤機(jī)制，為研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。方法:對(duì)44種新合成的化合物進(jìn)行初篩，篩選出一種水溶性好，抗腫瘤效果明顯的14號(hào)靛玉紅類化合物吲哚-3-取代物A。通過(guò)小鼠HepS移植瘤模型試驗(yàn)檢測(cè)吲哚-3-取代物A的體內(nèi)抑瘤作用。以不同濃度的吲哚-3-取代物A分別作用于SGC、HepG2、HeLa、A549四種腫瘤細(xì)胞株48h，MTT法檢測(cè)

2、化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算IC50值;選取HepG2細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤機(jī)制研究。PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期;DAPI染色及活細(xì)胞工作站觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核的變化;Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;分別采用DCFH-DA、JC-1、Fluo-3/AM染色、熒光素酶法及Clark氧電極檢測(cè)線粒體ROS生成、膜電位、胞內(nèi)Ca2+、ATP含量及細(xì)胞呼吸等功能性指標(biāo);Westernblot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、cdc2及Bcl-

3、2、Bax的表達(dá)，caspase3、8、9的活化;檢測(cè)化合物對(duì)線粒體腫脹的影響以分析其與線粒體的直接作用。
　　 結(jié)果:通過(guò)MTT檢測(cè)和相差顯微鏡觀察5-80μmol/L6個(gè)濃度梯度的吲哚-3-取代物A作用于四種腫瘤細(xì)胞株，計(jì)算其IC50值在4-13μmol/L之間。其中吲哚-3-取代物A對(duì)HepG2細(xì)胞的作用最為敏感，并且時(shí)間和劑量依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的增殖。同時(shí)，化合物抑制HepG2細(xì)胞的集落形成。吲哚-3-取代物A體

4、內(nèi)抑瘤率達(dá)到60.O9％，抑瘤效果高于5-FU，且沒(méi)有明顯的毒副作用。吲哚-3-取代物A誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，明顯降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cdc2和cyclinB1的表達(dá)水平;吲哚-3-取代物A作用于HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡特征，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期凋亡，且依賴于caspases的激活，裂解活化caspase3、8、9。另外，吲哚-3-取代物A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡涉及到Bcl-2家族的蛋白水平的變化，降

5、低Bax的蛋白表達(dá)水平，時(shí)間依賴性增加Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。通過(guò)進(jìn)一步研究對(duì)線粒體功能的影響，發(fā)現(xiàn)吲哚-3-取代物A能夠部分清除細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，同時(shí)還影響線粒體功能，如線粒體膜電位降低、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平的增加。通過(guò)吲哚-3-取代物A作用于離體線粒體發(fā)現(xiàn)，化合物不能夠?qū)笴a2+誘導(dǎo)的線粒體的腫脹，但能夠抑制線粒體內(nèi)的ROS的生成，降低線粒體膜電位，損傷線粒體的功能。
　　 結(jié)論:吲哚-3-取代物A具有