呫噸酮類化合物抗腫瘤作用及機制研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤是當前危害人類健康的主要疾病之一。目前治療腫瘤的方法主要有手術、放射、藥物和免疫療法?；瘜W藥物治療是腫瘤治療中發(fā)展最快的一個領域，在腫瘤的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)離不開抗癌藥物的篩選，從天然產(chǎn)物中提取抗癌活性成分，或通過結構改造合成新的先導化合物，從中篩選出新的抗癌藥物的新藥發(fā)展途徑依然非常重要。咕噸酮又叫二苯并γ吡喃酮，其母體本身并不存在于植物中，但其衍生物廣泛分布在自然界中，是藥用植物的有效成分之一

2、。自然界中得到的咕噸酮衍生物主要是從龍膽科、?？?、藤黃科、遠志科和金絲桃屬等科屬植物以及一些真菌的代謝產(chǎn)物中分離得到。由于大多數(shù)的呫噸酮衍生物在其線性排列的三個環(huán)上有酚性官能團，所以它們經(jīng)常表現(xiàn)出廣泛的生物和藥理活性。我國民間所用于治療肝炎、類風濕、挫傷、神經(jīng)痛、肺結核、哮喘等疾病的藥物，常富含呫噸酮類衍生物成分。
　　 第一部分咕噸酮類化合物體外抗增殖活性實驗。
　　 ⑴體外抗腫瘤增殖活性篩選。
　　 方法：體

3、外噻唑藍(MTT)法，分別取對數(shù)生長期的HepG2細胞、Lovo細胞、KB-3-1細胞、CNE-2細胞、HeLa細胞、Capan2細胞、K562細胞、U937細胞，每種化合物均設不同劑量的用藥組及相應的溶劑對照組培養(yǎng)72h，實驗終止前4h加入MTT溶液，待完全顯色后用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔OD值。按公式求出增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50值)。所有實驗均重復3～6次。
　　 結果：總體上此系列化合物對不同的腫瘤細胞株敏感性有差異

4、，其中多數(shù)的化合物對肝癌細胞HepG2的敏感性較其他的實體瘤要高。在咕噸酮的母核上引入羥基、乙?；⑼榛然鶊F后，抗腫瘤活性多出現(xiàn)不同程度增加。尤其是羥基的引入，C-3位點環(huán)氧環(huán)、鄰雙醇和哌啶基團的引入和苯咕噸酮的結構改造能使體外抗腫瘤作用有明顯的提升。
　　 ⑵對肝癌細胞HepG2與正常肝細胞L02的抑制活性和腫瘤的選擇性。
　　 方法：培養(yǎng)L02肝細胞。使用上述MTT法對比分析活性最好的6個化合物對肝癌細胞HepG2

5、和正常肝細胞L02的體外抗增殖作用差異，用IC50L02/IC50HepG2求出腫瘤選擇系數(shù)。
　　 結果：篩選出的6個抗肝癌細胞HepG2活性最好的化合物對HepG2和L02的腫瘤選擇系數(shù)為6.8～12.5，遠高于阿霉素的腫瘤選擇系數(shù)1.6，表現(xiàn)出對腫瘤細胞作用的良好選擇性。見表1.2
　　 第二部分 LY11誘導人肝癌HepG2細胞凋亡及相關機理研究。
　　 ⑴激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)。
　　

6、 方法：取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于激光共聚焦顯微鏡專用細胞培養(yǎng)皿，設高中低劑量組，48h終止作用，處理細胞，DAPI染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 結果：未處理的HepG2細胞核呈彌散均勻較弱熒光。LY11作用后呈現(xiàn)典型的凋亡細胞型態(tài)：細胞變小，染色質(zhì)濃縮，熒光強度增強，有些細胞染色質(zhì)聚集于核膜下，呈新月狀，有些分葉塊狀，部分凋亡小體形成，
　　 ⑵流式細胞儀檢測細胞周期改變。
　　 方法：收集

7、不同濃度、不同時間的LY11處理后的HepG2細胞，PBS洗滌2次，70％乙醇固定過夜。離心棄乙醇，再次懸浮于PBS，細胞經(jīng)溴化丙啶(PI，10μg/ml)染色，在流式細胞儀上檢測細胞DNA含量，得出每份樣品的G1,、S和G2/M期細胞分布圖以及亞G1期(凋亡)細胞所占比例。LYSIS軟件(BectonDickinson公司產(chǎn)品)分析。
　　 結果：流式細胞儀分析顯示，經(jīng)過8μM的LY11處理HepG2細胞12h，24h，36h

8、后，和經(jīng)過2μM、4μM、8μM的LY11處理48h后，與未處理組的HepG2細胞比較，經(jīng)過統(tǒng)計分析，處理組和未處理組之間的G1、S、G2/M期各期細胞所占比例未見明顯變化，可見LY11對HepG2細胞無周期特異性作用。
　　 ⑶Annexin V/PI染色觀察細胞凋亡。
　　 方法：將處理后的HepG2細胞用不含EDTA的胰酶消化收集;用PBS洗滌，收集細胞；用Binding Buffer懸浮細胞；加入5μLAnnex

9、in V-FITC混勻后，再加入5μL Propidium Iodide，混勻;室溫避光反應，進行流式細胞儀的觀察和檢測。
　　 結果：結果顯示經(jīng)過8μM的LY11分別處理12h、24h、36h后，HepG2細胞的凋亡率分別為17.0％、26.8％、30.7％，經(jīng)過2μM、4μM、8μM的LY11處理48h后HepG2細胞的凋亡率分別為11.3％、30.6％、35.2％。結果可見HepG2細胞的凋亡率隨著LY11作用時間的延長或

10、者作用濃度的提高而增加。
　　 ⑷LY11對TopoⅡ酶活性的抑制作用。
　　 方法：配置反應Buffer：50mM Tris-HCl(pH7.5)，120mM KC1，10mM MgCl2，0.5mM dithiothreitol，1mM ATP，在反應Buffer中加入0.2μg的pBR322，加入4U的TopoⅡ，加入不同濃度的LY11，充分混合，置于37℃作用30分鐘，35V，4小時電泳，凝膠以EB染色10分鐘；

11、觀察結果。
　　 結果：本研究使用pBR322為底物檢測了LY11對TopoⅡ酶活性的抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)16μM，4μM和1μM的LY11均能產(chǎn)生對TopoⅡ酶的抑制作用，與濃度呈量效關系。
　　 ⑸LY11對HepG2細胞Topo H蛋白表達的影響。
　　 方法：同第2章
　　 結果：Western Blot分析顯示，經(jīng)過2μM、4μM、8μM的LY11處理48h后，HepG2細胞的TopoⅡ蛋白表達出

12、現(xiàn)明顯改變。隨著濃度的升高，TopoⅡ蛋白表達出現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢。經(jīng)過4μM的LY11處理24h、36h、48h后，HepG2細胞的TopoⅡ蛋白表達也出現(xiàn)明顯改變，隨著作用時間的延長，TopoⅡ蛋白表達出現(xiàn)了明顯的下調(diào)趨勢。
　　 ⑹RT-PCR法檢測TopoⅡαmRNA表達情況。
　　 方法：經(jīng)過2μM、4μM、8μM的LY11處理HepG2細胞48h后，按照文獻報道使用Trizol提取各組細胞的總RNA，按照試劑盒

13、操作說明書，進行RNA逆轉錄反應。將反應產(chǎn)物進行PCR反應。電泳，觀察結果。
　　 結果：RT-PCR結果顯示，隨著LY11處理濃度的增高，TopoⅡα的mRNA的表達下降，當LY11的處理濃度增加至8μM時，HepG2細胞的TopoⅡ的mRNA基因表達明顯下降。
　　 ⑺彗星實驗觀察DNA損傷。
　　 方法：將LY11處理后的細胞洗滌離心收集，磨砂玻片浸入正常熔點瓊脂糖中，制成第一層膠。取細胞懸液加入低熔點瓊脂

14、糖混勻，滴在第一層膠上，制成第二層膠。裂解后25V穩(wěn)壓電泳20min，中和后PI染色，熒光顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計拖尾率，測尾長。
　　 結果：收集經(jīng)過不同濃度的LY11和20μM的DDP處理24h后的HepG2細胞，經(jīng)過單細胞凝膠電泳實驗后觀察可見，隨著LY11濃度的增高(0、2、4、8μM)，彗星現(xiàn)象逐漸明顯，分析發(fā)現(xiàn)處理組和未處理組間的彗星拖尾率和尾距均有明顯差異。
　　 結論：
　　 ①本系列咕噸酮化合物對

15、人肝細胞癌細胞株HepG2有相對較好的抗增殖活性，其中化合物LY11活性最強?；钚暂^強的六個化合物的抗HepG2增殖作用與抗正常肝細胞L02增殖作用相比，顯出了良好的腫瘤選擇性效應。
　　 ②本系列咕噸酮化合物抗腫瘤細胞HepG2活性的構效關系分析顯示，在咕噸酮母核上引入羥基，增加苯環(huán)或在C-3位上引入環(huán)氧乙烷基均可能有助于抗腫瘤活性的提高。
　　 ③對化合物LY11的研究表明，LY11能抑制抗凋亡基因Mcl-1的蛋白表