肝癌治療潛在靶點c-Met及腫瘤靶向治療效果及機制研究.pdf

1、研究背景和目標：
　　 肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康。在中國，由于存在較為嚴重的乙型肝炎病毒(HBV)感染等致癌風險因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率態(tài)勢尤為嚴峻。肝癌的治療手段主要包括肝移植、腫瘤切除及非切除性局部療法如肝動脈化療栓塞等。由于肝癌特別是肝細胞肝癌(HCC)早期易發(fā)生轉移以及治療后易復發(fā)，系統(tǒng)化療是臨床上亟需的HCC治療手段。靶向于酪氨酸激酶受體(recepto

2、r tyrosine kinase，RTK)的索拉菲尼(Sorafinib)是近年來在美國等多個國家批準應用于臨床的第一個對HCC有效的系統(tǒng)化療藥物，是HCC分子靶向治療研究進程中的一座里程碑。c-Met是RTK家族的典型成員之一，是當前抗腫瘤分子靶向藥物研制的一個重要的靶點。然而，由于c-Met信號通路在HCC病理學狀態(tài)下有諸多不明之處，以c-Met為靶點的抗HCC藥物的研究與開發(fā)較為遲緩。我們課題組前期有關脫-γ-羧基凝血酶原(de

3、s-γ-carboxy prothrombin，DCP)的基礎研究發(fā)現(xiàn)DCP能夠激活c-Met信號傳導通路，對HCC細胞增殖和侵襲具有促進作用，可能在人HCC的發(fā)病和進展中發(fā)揮了重要的作用。在此基礎上對HCC病理狀態(tài)下c-Met信號通路傳導機制的重新審視和進一步研究，將有助于更好地理解HCC的發(fā)病機制并推動抗HCC分子靶向藥物研究與開發(fā)的進程。
　　 基質金屬蛋白酶氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN/CD13)在

4、促進腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮了重要的作用，是當前抗腫瘤侵襲和轉移藥物研究中的重要靶酶之一。腫瘤細胞早期易發(fā)生轉移以及由此導致的治療后易復發(fā)是HCC最為顯著的特點，因此控制腫瘤侵襲和轉移在HCC的治療中具有十分重要的意義。既往的研究表明，HCC細胞株APN/CD13表達水平較高，可能與其易發(fā)生轉移的行為有關。因此APN/CD13抑制劑可能具有較好地控制HCC侵襲和轉移的效果。肝臟是人體最大的實質性臟器，血供豐富，被認為是體內(nèi)僅次于淋巴結的轉

5、移癌好發(fā)部位。卵巢癌肝轉移后形成的繼發(fā)性肝癌是臨床常見的轉移癌類型。當肝轉移灶為多發(fā)性同時化療又不敏感時，治療將非常困難。因此，尋找新型的有效的卵巢癌治療藥物具有重要的意義。研究表明，APN/CD13在卵巢癌細胞有較高水平的表達，是抗卵巢癌藥物研發(fā)的靶點之一。因此本課題的另一個目標是研究APN/CD13抑制劑抗HCC侵襲和轉移的效果以及探討該類抑制劑對易發(fā)生肝轉移的卵巢癌的抗腫瘤效果和機制。
　　 第一章 HCC病理狀態(tài)下DCP

6、/c-Met的表達及臨床意義
　　 第一節(jié).DCP在HCC組織中的表達特征和血清中的含量及其臨床意義
　　 目的：測定DCP在人HCC組織中的表達特征和在血清中的含量并分析其與HCC臨床病理學因素的關系，探討DCP在人HCC演進過程中的促進作用。
　　 方法：選取92例行手術切除治療的單發(fā)性HCC患者，收集并統(tǒng)計患者臨床病理學因素包括年齡、性別、背景肝組織病毒感染和肝硬化狀況、腫瘤病程進展、腫瘤分化程度、腫瘤體積

7、、血管侵襲狀況和肝內(nèi)轉移狀況等。免疫組化法測定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中DCP的表達，酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)測定患者血清中DCP的含量。采用x2檢驗分別分析腫瘤組織中DCP的表達和血清中DCP含量與臨床病理學因素的相關性。采用Kaplan-Meier法計算術后患者的生存率，并以log-rank檢驗比較DCP血清含量高/低兩組患者五年生存率的差異。以Cox風險回歸模型分析影響患者術后生存的因素。
　　 結果：免疫組化研究

8、結果顯示73.9％的患者HCC組織中DCP的表達呈陽性。DCP在腫瘤組織中的表達與腫瘤的生長方式有關，浸潤性生長或無包膜的腫瘤中DCP表達的陽性率顯著高于膨脹性生長或有包膜的腫瘤，提示DCP的存在可能加重了腫瘤的惡性程度，促進了腫瘤細胞向周圍非腫瘤組織的侵襲。ELISA檢測結果顯示44.6％的患者血清DCP的含量高于HCC診斷截斷值0.0625 AU/ml。HBsAg陽性、腫瘤中等分化程度、腫瘤存在血管侵襲和肝內(nèi)轉移、腫瘤病程處于Ⅲ/Ⅳ

9、期或腫瘤體積大于50 mm時，患者血清中往往含有超過截斷值的高水平的DCP含量?；颊哐錎CP的含量與術后生存期有關，血清中含有高水平DCP的患者五年生存率顯著低于血清中含有低水平DCP的患者。
　　 結論：DCP在HCC患者血清和腫瘤組織中普遍存在，與多種病理學因素相關。DCP的表達與腫瘤具有較高的惡性程度相關。結合我們課題組前期有關DCP促進HCC增殖、侵襲和轉移的實驗結果，已有的證據(jù)提示DCP在HCC的演進中可能發(fā)揮了重要

10、的促進作用。
　　 第二節(jié).HCC組織中DEP與c-Met共表達及臨床意義
　　 目的：探討DCP和c-Met在人HCC組織中表達是否具有一致性及其臨床意義
　　 方法：選取153例行手術切除治療的單發(fā)性HCC患者，收集并統(tǒng)計患者臨床病理學因素包括年齡、性別和術后HCC復發(fā)狀況。免疫組化法分別測定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中DCP和c-Met表達狀況。采用x2檢驗分析組織中DCP和c-Met存在的相關性以及DCP/

11、c-Met表達與HCC復發(fā)的關系。
　　 結果：DCP在腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中的陽性表達率分別為63.4％(97/153)和13.1％(20/154)，c-Met在腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織中的陽性表達率分別為66.7％(102/153)和28.8％(44/153)。DCP和c-Met在腫瘤組織中的陽性表達率均顯著高于其在癌旁非腫瘤組織中的表達率。在腫瘤組織中，51％(78/153)的病例DCP和c-Met表達同時為陽性，20

12、.9％(32/153)的病例二者的表達同時為陰性。在非腫瘤組織中，7.2％(11/153)的病例DCP和c-Met表達同時為陽性，65.4％(100/153)的病例二者的表達同時為陰性。在整個組織標本中，58.2％(89/153)的病例DCP和c-Met表達同時為陽性，19.6％(30/153)的病例二者的表達同時為陰性。x2檢驗表明DCP和c-Met在HCC標本中的存在具有相關性。c-Met在腫瘤組織中的表達與術后HCC復發(fā)有關。c-

13、Met結合DCP比c-Met單獨對預測術后HCC復發(fā)的意義更顯著。c-Met和DCP在HCC標本中的表達均為陰性時，該組病人術后復發(fā)率低于c-Met或DCP表達為陰性的各組患者的復發(fā)率。
　　 結論：c-Met和DCP在HCC組織中的表達具有廣泛性和一致性，與HCC術后高復發(fā)率有關。當二者表達均為陰性時，HCC患者術后復發(fā)率較低。
　　 第二章 c-Met抑制劑抗HCC效果及機制研究
　　 目的：探討c-Met激

14、酶小分子抑制劑SU11274對HCC細胞增殖的抑制作用。
　　 方法：選用高分化型HCC細胞株HepG2和HuH-7及低分化型HCC細胞株HLE，MTT法分別測定：①DCP對三種細胞增殖的刺激作用；②c-Met激酶抑制劑SU11274對三種細胞增殖的抑制作用；③同時加入DCP和SU11274對三種細胞增殖的影響。Western blot法測定SU11274對HepG2、HuH-7和HLE細胞c-Met、磷酸化c-Met和磷酸化E

15、RK水平的影響。
　　 結果：c-Met激酶特異性小分子抑制劑SU11274具有抑制HCC細胞生長增殖的活性。其對分化性高的細胞株HepG2和。HuH7以及分化性低的細胞株HLE增殖的半數(shù)抑制濃度類似，均在6-9μM范圍內(nèi)。DCP對肝癌細胞株的增殖有不同程度的刺激作用。SU11274能夠抑制或抵消DCP促進HCC細胞生長增殖的生物學作用。SU11274能夠降低細胞磷酸化c-Met、磷酸化ERK的水平，從而抑制c-Met信號通路的

16、傳導。
　　 結論：c-Met激酶小分子抑制劑SU11274能夠顯著地抑制HCC細胞生長增殖，并能對抗或抵消DCP促進HCC細胞增殖的作用。抑制c-Met激酶活性可能是抗HCC藥物研究與開發(fā)的合理策略，該類抑制劑可能對表達DCP的HCC更有效。
　　 第三章 APN/CD13抑制劑抗腫瘤效果及機制研究
　　 第一節(jié).APN/CD13抑制劑抗HCC侵襲及新血管生成研究
　　 目的：探討APN/CD13抑制劑

17、24F對HCC細胞侵襲和新血管生成的抑制作用
　　 方法：選用人HCC細胞HuH-7和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC，二者均表達APN/CD13。以L-亮氨酸對硝基苯胺為底物測定24F對APN/CD13酶活性的抑制作用。MTT法測定24F對HuH-7細胞增殖的抑制作用。Transwell細胞侵襲實驗測定24F對HuH-7細胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。微管形成實驗測定24F對HUVEC細胞在Matrigel表面形成微管樣結構的

18、抑制作用。
　　 結果：化合物24F對APN/CD13酶活性的半數(shù)抑制濃度為1.88 mM。24F在0-200μg/mL濃度范圍內(nèi)對HuH-7細胞的增殖具有輕微地抑制作用，未觀察到該化合物對HuH-7有明顯的細胞毒效應。體外細胞侵襲實驗結果表明，24F能夠減少穿過Matrigel的HuH-7細胞數(shù)目，顯示其對腫瘤細胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。24F能夠在體外抑制血管內(nèi)皮細胞HUVEC形成微管樣結構，提示24F具有潛在的抑制腫

19、瘤新血管生成的能力。
　　 結論：APN/CD13抑制劑24F對HCC細胞侵襲和游走運動能力具有抑制作用，對血管內(nèi)皮細胞HUVEC微管形成具有抑制作用，提示APN/CD13抑制劑在抗HCC侵襲轉移及新血管生成方面具有潛在的應用價值。
　　 第二節(jié).APN/CD13抑制劑抗卵巢癌增殖及新血管生成研究
　　 目的：探討APN/CD13抑制劑LYP對卵巢癌生長增殖及新血管生成的抑制作用。
　　 方法：體外實驗選

20、用人卵巢癌細胞株ES-2和SKOV-3以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC。三種細胞均表達APN/CD13，表達水平由高到低依次為ES2、SKOV-3和HUVEC。MTT實驗測定LYP對細胞增殖的抑制作用。臺盼藍實驗檢測LYP的細胞毒效應。以L-亮氨酸對硝基苯胺為底物測定LYP對APN/CD13酶活性的抑制作用。流式細胞術和Western blot實驗分別測定LYP對細胞APN/CD13表達水平的影響。劃痕實驗和Transwell侵襲實驗

21、觀察LYP對HUVEC細胞侵襲和游走運動能力的抑制作用。微管形成實驗測定LYP對HUVEC細胞在Matrigel表面形成微管結構的抑制作用。裸鼠接種ES-2細胞后尾靜脈給予LYP治療兩周，觀察藥物對ES-2腫瘤生長的抑制作用和裸鼠對給藥方案的耐受性。CD34免疫組化實驗測定LYP對ES-2腫瘤組織平均血管密度和平均血管直徑的影響。Western blot實驗測定LYP對腫瘤組織內(nèi)APN/CD13、VEGF、bFGF和TGFα表達水平的影

22、響。
　　 結果：MTT實驗結果表明LYP能夠有效的抑制ES-2細胞的增殖。LYP對ES-2細胞APN/CD13酶的活性具有顯著的抑制作用。相同濃度下，LYP對APN/CD13酶活性的抑制作用大于烏苯美司。相對于ES-2細胞，LYP對SKOV-3細胞增殖的抑制作用較弱，提示LYP對ES-2細胞增殖的抑制作用可能與抑制APN/CD13有關。流式細胞術實驗和Western blot實驗表明LYP能夠降低體外培養(yǎng)ES-2細胞APN/C

23、D13的表達水平。裸鼠接種ES-2細胞后尾靜脈給予LYP，連續(xù)治療兩周，ES-2腫瘤的生長受到顯著的抑制作用。Western blot實驗結果顯示LYP能夠降低腫瘤組織APN/CD13的含量。與陽性對照藥烏苯美司相比，LYP對ES-2腫瘤生長的抑制作用較強。裸鼠對給藥方案的耐受性良好，給藥組裸鼠的體重與陰性對照組比較沒有顯著性差異。
　　 為進一步研究LYP抑制體內(nèi)ES-2腫瘤生長作用背后的機制，我們檢測了LYP在抑制新血管生成

24、方面的藥理活性。MTT實驗和臺盼藍實驗結果顯示在5-80μM濃度范圍內(nèi)，LYP對HUVEC細胞沒有明顯的細胞毒效應。在該濃度范圍內(nèi)LYP對HUVEC細胞APN/CD13酶的活性有一定的抑制作用。Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結果顯示LYP能夠明顯抑制HUVEC細胞的侵襲和游走運動能力。微管形成實驗表明LYP對HUVEC細胞在Matrigel表面形成微管樣結構具有抑制作用。LYP對新血管生成的抑制作用在體內(nèi)實驗中得到了驗證。對ES-

25、2腫瘤組織進行CD34免疫染色，結果發(fā)現(xiàn)LYP給藥組腫瘤平均血管密度和平均血管直徑均小于陰性對照組。在相同給藥劑量下，LYP抑制新血管生成的作用大于陽性對照藥烏苯美司。LYP的抗微血管生成作用可能與其抑制與血管生成有關的分子的表達有關。Western blot實驗結果顯示，LYP給藥組腫瘤組織內(nèi)VEGF、bFGF和TGF-α的水平顯著低于陰性對照組。
　　 結論：LYP在體外和體內(nèi)對卵巢癌細胞生長增殖具有較強的抑制作用，該作用可