以Src家族同源結(jié)構(gòu)域?yàn)榭鼓[瘤治療靶位點(diǎn)的研究.pdf

1、研究背景和目標(biāo)： 近年來，隨著生命科學(xué)研究的飛速進(jìn)展，惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、血管生成以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用等各種基本過程正在被逐步闡明。為抗癌藥物的研制提供了新的契機(jī)。研究表明大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移均與多種酪氨酸激酶的過表達(dá)有著密切的關(guān)系。然而，不論是正常的基因還是癌基因編碼的蛋白酪氨酸激酶在與下游蛋白相互作用時(shí)都需要共同的結(jié)構(gòu)單元－Src 家族同源結(jié)構(gòu)域2 和3（Srchomol

2、ogy domain，SH2&SH3）。兩者通過介導(dǎo)酪氨酸激酶與含有磷酸化酪氨酸序列的蛋白分子相互作用從而參與許多重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。正是由于SH2和SH3 介導(dǎo)的蛋白結(jié)合在多種酪氨酸激酶始動(dòng)的細(xì)胞增殖信號中發(fā)揮著重要作用，因此Src 家族同源結(jié)構(gòu)域正逐漸成為新的抗腫瘤治療靶位點(diǎn)。 基于相關(guān)研究背景，我們將PTD-BCR/ABL SH3 融合蛋白應(yīng)用于荷肝癌HepG-2 腫瘤裸鼠的治療性研究，探討該蛋白對肝癌HepG-2

3、腫瘤生長的體內(nèi)抑制作用以及對裸鼠生存期的影響。以相似的蛋白構(gòu)建原則構(gòu)建含有Grb2－ SH2 的原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化含有TAT48-60（GRKKRRQRRRPPQ）序列的His-PTD-Grb2-SH2 融合蛋白。將His-PTD-Grb2-SH2 融合蛋白應(yīng)用于體外功能實(shí)驗(yàn)初步探討其生物學(xué)活性。從而為以Src 家族同源結(jié)構(gòu)域作為抗腫瘤靶位點(diǎn)的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 我們選擇Balb/C裸鼠

4、通過肢體單側(cè)皮下分別接種1×106 HepG-2 細(xì)胞構(gòu)建裸鼠荷肝癌HepG-2 腫瘤模型，然后將PTD-BCR/ABL SH3 融合蛋白采用局部注射的方式干預(yù)腫瘤生長并影響裸鼠的生存時(shí)間。另一方面我們采用PTD-BCR/ABL SH3 融合蛋白設(shè)計(jì)原理，構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，將編碼Grb2－SH2 結(jié)構(gòu)域的cDNA導(dǎo)入pET-16b-PTD原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化同時(shí)含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和Grb2－SH2 結(jié)構(gòu)域的融合蛋白--His-P

5、TD-Grb2-SH2，經(jīng)Western-blot鑒定后將該融合蛋白用于初步的體外實(shí)驗(yàn)研究。通過免疫熒光方法鑒定His-PTD-Grb2-SH2 融合蛋白是否能夠順利通過細(xì)胞膜，光鏡觀察該蛋白對于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響，MTT(噻唑藍(lán))法測定細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞生長抑制率進(jìn)一步研究該蛋白在體外對于細(xì)胞的增殖的影響。 研究結(jié)果： 在對荷肝癌細(xì)胞系HepG-2 腫瘤裸鼠的治療性研究中，PTD-BCR/ABLSH3 融合蛋白表現(xiàn)出顯

6、著的抗腫瘤效應(yīng)。該蛋白能夠明顯抑制腫瘤生長，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積明顯小于對照組，在生存時(shí)間上該蛋白的應(yīng)用明顯有益于荷瘤裸鼠的生存期延長。在以SH2 結(jié)構(gòu)域?yàn)榘形稽c(diǎn)的研究中，通過基因重組技術(shù)我們成功構(gòu)建，經(jīng)過酶切鑒定及測序結(jié)果證實(shí)獲得含有Grb2-SH2 結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)載體。經(jīng)過表達(dá)、純化及Western-blot 鑒定，我們得到了一種全新的融合蛋白His-PTD-Grb2-SH2。體外研究表明，該蛋白能夠順利通過乳腺癌SKBR-3 細(xì)胞和胃

7、癌SGC－7901 細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)分布在胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，MTT(噻唑藍(lán))法測定細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞生長抑制率進(jìn)一步證明該蛋白在體外對于兩種腫瘤細(xì)胞的增殖有著明顯的抑制作用。 結(jié)論：以Src 家族同源結(jié)構(gòu)域作為抗腫瘤靶位點(diǎn)的研究中，我們采取全新思路，通過直接將SH2和SH3 結(jié)構(gòu)域?qū)爰?xì)胞內(nèi)競爭結(jié)合相應(yīng)的底物位點(diǎn)從而干擾細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑獲得成功。在體內(nèi)研究中PTD-BCR/ABL SH3 融合蛋白通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而抑制腫瘤生