以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域?yàn)榘悬c(diǎn)的新型咪唑類化合物的抗菌效應(yīng)研究.pdf

1、目的：
　　本課題組前期采用分子對(duì)接的方法，篩選出以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)的咪唑類化合物6，其在體外展示出較好的抗菌活性，但其體內(nèi)保護(hù)效果不理想，且細(xì)胞毒性較高。本研究擬以肺炎鏈球菌WalK酶HATPase-c結(jié)構(gòu)域（CA結(jié)構(gòu)域）三維結(jié)構(gòu)中氨基酸功能殘基為藥物作用靶點(diǎn)，采用化合物6為先導(dǎo)結(jié)構(gòu)模板，設(shè)計(jì)并合成一系列新型咪唑類抗菌化合物。通過化合物和三種不同的WalK蛋白相互作用，驗(yàn)證新型化合物抗菌靶點(diǎn)

2、位于肺炎鏈球菌WalK酶CA結(jié)構(gòu)域；通過體外實(shí)驗(yàn)考查化合物抗菌活性及毒性反應(yīng)；通過建立小鼠肺炎鏈球菌感染模型，檢測(cè)其體內(nèi)抗菌效應(yīng)。本研究擬最終獲得毒性小、體內(nèi)抗菌活性高、可能具有廣譜抗革蘭陽(yáng)性菌的新型抗菌藥物。
　　方法:
　　本課題擬通過分子設(shè)計(jì)—合成—生物活性測(cè)試模式，采用活性基團(tuán)拼接法和取代法，合成一系列新型咪唑類抗菌藥物；再對(duì)合成的咪唑類抗菌藥物進(jìn)行元素、1H NMR、13C NMR、MS(ESI)、熔點(diǎn)、遠(yuǎn)紅外光譜

3、等表征分析。利用PCR法擴(kuò)增3種不同肺炎鏈球菌WalK基因序列（全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域），并構(gòu)建3種WalK基因序列的重組ppSUMO質(zhì)粒，再將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，依靠IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及Ni-NTA親和層析，得到純度較高的可溶性目的蛋白；利用該蛋白免疫BALB/C小鼠獲取多克隆抗體，經(jīng)ELISA法檢測(cè)其特異性IgG抗體效價(jià)，經(jīng)Western Blot鑒定WalK全長(zhǎng)蛋白在4種S.pn血清型菌株中的保守性。利

4、用ATP激酶發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)以上三種蛋白的激酶活性，檢測(cè)蛋白與新型咪唑類化合物作用后的激酶活性變化（IC50）。通過最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）及細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT法）等實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的體外抗菌效應(yīng)以及細(xì)胞毒性作用。構(gòu)建BALB/C小鼠的腹腔S.pn感染模型，通過尾靜脈注射途徑給藥，觀察小鼠的生存時(shí)間和生存率。
　　結(jié)果：
　　本課題組前期已經(jīng)成功合成以原始化合物6為母體的15種新型咪唑類化合物，并對(duì)其

5、中的6種化合物進(jìn)行了1H NMR、13C NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜、熔點(diǎn)等結(jié)構(gòu)和組成表征分析，結(jié)果提示為預(yù)期目標(biāo)分子。成功構(gòu)建和表達(dá)WalK（全長(zhǎng)、缺陷CA結(jié)構(gòu)域、僅含有CA結(jié)構(gòu)域）重組蛋白；以全長(zhǎng)WalK蛋白免疫小鼠后獲得高滴度的多克隆抗體，Western Blot分析證實(shí)，CMCC(B)31207、CMCC(B)31203、CMCC(B)31693、NTCC7466(D39)等4種S.pn菌株均能穩(wěn)定的表達(dá)WalK全長(zhǎng)蛋白。隨著

6、新型咪唑類化合物（2號(hào)、4號(hào)及5號(hào)）藥物濃度的逐漸增高，WalK全長(zhǎng)組和僅含有CA結(jié)構(gòu)域組ATP激酶活性均持續(xù)降低（均P<0.05）；而不同濃度的新型咪唑類化合物（2號(hào)、4號(hào)及5號(hào)）與缺陷CA結(jié)構(gòu)域組作用，其ATP激酶活性變化無明顯差異（P>0.05）。通過最小抑菌濃度、最小殺菌濃度等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，新合成咪唑類化合物2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)均具有較好的抑菌及殺菌效應(yīng)，其中4號(hào)化合物抑菌及殺菌效果最為明顯（P<0.01）；細(xì)胞毒性試驗(yàn)證實(shí)，三種化

7、合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物（P<0.01），其中以2號(hào)細(xì)胞毒性最低(1170μM)?；衔飳?duì)腹腔感染D39型肺炎鏈球菌小鼠的治療效果證實(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組（PNC組）比較，原始化合物6號(hào)、新合成咪唑類化合物4號(hào)、5號(hào)的保護(hù)效果均未見明顯差異（均P>0.05）；2號(hào)化合物與陽(yáng)性對(duì)照組間比較其保護(hù)效果明顯降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　WalK全長(zhǎng)重組蛋白在不同血清型S.pn中保守性較好，新合成咪唑類化合物（2號(hào)、4號(hào)

8、及5號(hào)）具有抑制WalK酶CA結(jié)構(gòu)域ATP激酶活性的效應(yīng)；最小抑菌濃度和最小殺菌濃度試驗(yàn)均證實(shí)4號(hào)化合物在體外具有極佳的抗菌及殺菌效應(yīng)；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)以2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)化合物細(xì)胞毒性均顯著低于原始化合物；體內(nèi)抗菌效應(yīng)試驗(yàn)提示新合成的咪唑類化合物4號(hào)、5號(hào)均能夠明顯延長(zhǎng)腹腔感染肺炎鏈球菌D39小鼠的生存時(shí)間。
　　本研究首次證實(shí)新合成的4號(hào)咪唑類化合物可能是未來治療肺炎鏈球菌感染的新型藥物，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將著重其藥物代謝學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)方