硫酯酶結構域和酮內(nèi)酯類化合物生物合成之間關系的研究.pdf

1、紅霉素(erythromycin)C-3位羥基由模塊6中酮還原酶(ketoreductase，KR)決定，因此，通過基因工程的方法敲除或使KR6喪失功能后，C-3位可保持酮基狀態(tài)。利用染色體同源重組技術已構建了一系列糖多孢紅霉菌KR6突變體，均合成酮內(nèi)酯類化合物3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B(3-deoxy-3-oxo-6-deoxy-erythronolideB，DODEB)，并進一步被羥基化修飾為3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)

2、酯B(3-deoxy-3-oxo-erythronolideB，DOEB)，然而產(chǎn)量比較低。 在聚酮合成酶(polyketidesynthase，PKS)中，硫酯酶(thioesterase，TE)負責將聚酮長鏈從PKS上水解下來，并在其它酶域的協(xié)助下環(huán)化為大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，因此對聚酮的生物合成非常重要。DODEB的環(huán)化前體β-長鏈酮脂肪酸不是紅霉素TE(EryTE)的天然底物，EryTE對它的催化效率可能會降低。為研究TE酶結構域與

3、酮內(nèi)酯類化合物合成之間的關系，克隆了EryTE的基因，分別連接到表達載體pZM和pZMW上構建表達質(zhì)粒。PEG介導原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌KR6突變體中表達。以乙酸乙酯萃取發(fā)酵產(chǎn)物，通過薄層層析和枯草桿菌抑菌試驗進行產(chǎn)物及活性檢測。結果顯示EryTE并沒有顯著促進酮內(nèi)酯類化合物DODEB的合成。研究指出，載體蛋白(acylcarrierprotein，ACP)與TE結合在一起更能有效發(fā)揮TE酶結構域的催化活性，因此，又克

4、隆了紅霉素ACP6-TE(EryACP6-TE)的基因并轉(zhuǎn)入KR6突變體表達，仍舊沒有顯著促進DODEB的合成。 C-3位的酮基是影響EryTE活性的最大可能部位，苦霉素(pikromycin)TE催化C-3位為酮基的聚酮鏈底物的能力遠比EryTE為高。為此，克隆了苦霉素ACP-TE(PikACP-TE)的基因并轉(zhuǎn)入KR6突變體中表達，結果也沒有檢測到DODEB合成產(chǎn)量的顯著提高。這揭示了，結構域獨立于聚酮合成酶模塊(modul

5、e，M)時，不能有效發(fā)揮功能，將TE酶結構域融合于模塊中或許可以有效發(fā)揮活性?；谏鲜鲈?，利用染色體同源重組技術，以苦霉素模塊6中PikACP-TE的基因直接替換糖多孢紅霉菌染色體模塊6中EryKR6-ACP6-TE的基因構建了TE酶結構域替換菌株A226-PTE。然而，質(zhì)譜分析A226-PTE的發(fā)酵液時并沒有檢測到DODEB及其修飾物的特征峰。推測雜合模塊中結構域間識別效率降低進而造成雜合模塊活性的下降，是沒有檢測到酮內(nèi)酯類化合物的

6、原因之一。 模塊是聚酮鏈合成的最小功能單位，因此，模塊替換可能更為合理。不過，考慮到整個模塊6的替換難度太大，因此，先將苦霉素模塊6(PikM6)的基因轉(zhuǎn)入KR6突變體中表達。結果顯示PikM6顯著促進酮內(nèi)酯類化合物的合成。表明，以獨立肽鏈形式存在的PikM6在糖多孢紅霉菌中可以充分發(fā)揮聚酮合成酶的功能，這為下一步的模塊替換提供了現(xiàn)實依據(jù)；同時也證實了，TE只有融合于模塊中，在模塊中其它所有結構域協(xié)助下，才可以充分發(fā)揮硫酯酶的功