PRMT2及其剪接體對雌激素受體ERα轉(zhuǎn)錄活性影響的相關(guān)研究.pdf

1、目的:比較不同條件下，PRMT2及其新的剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響；檢測PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與ERa在細(xì)胞外的相互作用。
　　方法：提取pcDNA3.0-PRMT2、pcDNA3.0-PRMT2α、pcDNA3.0-PRMT2β、pcDNA3.0-PRMT2γ及pcDNA3.0空載體質(zhì)粒，分別與pcDNA3.0-ERα瞬時共轉(zhuǎn)染（采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法）293T細(xì)

2、胞，建立螢火蟲熒光素酶雙報告基因檢測系統(tǒng)，選用含受雌激素反應(yīng)元件（ERE， estrogen response elements）一致序列調(diào)控的熒光素酶基因（ERE-Luc）作為報告基因，通過熒光測定儀檢測ERE-luc熒光素酶基因活性值，進而觀察PRMT2及其剪接體對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。該部分包括兩個內(nèi)容，其一觀察在有無雌激素條件下，PRMT2及PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ質(zhì)粒分別對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。其二是觀察雌激素

3、抑制劑4-羥基他莫西芬（4-OHT）、氟維司群（ICI182,780）條件下，PRMT2及其各剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。將表達融合蛋白GST-PRMT2及其剪接體的重組質(zhì)粒和表達GST的空載體pGEX-5T轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)融合蛋白的表達，將獲得的蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色法驗證蛋白表達水平。GST-Sepharose4B親和層析法純化GST-PRMT2α、G

4、ST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白及GST蛋白，將pcDNA3.0-ERα瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，運用GST pull-down技術(shù)檢測PRMT2及其各剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與ERα在細(xì)胞外相互作用情況，及其與雌激素的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，在雌激素不存在時，PRMT2及其剪接體對ERα轉(zhuǎn)錄活性無明顯提高。在雌激素存在時，與空載

5、體相比，PRMT2及其剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2r分別使ERα的轉(zhuǎn)錄活性提高了約2.9倍、1.7倍、1.5倍及2.1倍。
　　2.分別加入雌激素及雌激素抑制劑（ICI182,780，4-OHT）條件下,雌激素抑制劑可降低PRMT2及其剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3.通過GST pull-down技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，無論雌激素是否存在，GST蛋白與ERα不能結(jié)合，而G

6、ST-PRMT2α、GST-PRMT2β、GST-PRMT2γ融合蛋白均能分別與ERα結(jié)合。
　　結(jié)論：PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ與PRMT2一樣能以雌激素依賴的形式提高ERα轉(zhuǎn)錄活性,雌激素抑制劑能降低PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。PRMT2及其各剪接體PRMT2α、PRMT2β、PRMT2γ在細(xì)胞外均能以不依賴于雌激素形式與ERα相結(jié)合，雌激素對其可能有增強效應(yīng)。PRMT2及其各