新型雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)因子蛋白的功能研究.pdf

1、雌激素受體(estrogen receptor，ER)是核受體的一種，包括ERα和ERβ兩種，是調(diào)節(jié)與雌激素有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與靶基因上特異性效應(yīng)元件結(jié)合或通過(guò)與其他的轉(zhuǎn)錄因子(例如，AP1和SP1)相互作用從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。其作用的發(fā)揮需要共調(diào)節(jié)因子(coregulator)的參與。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多ERα的共調(diào)節(jié)因子，包括共激活子和共抑制子。由于ERβ是近期發(fā)現(xiàn)的，所以它的共調(diào)節(jié)因子報(bào)道很少。ER在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)

2、程中具有重要作用，是乳腺癌治療的靶標(biāo)和預(yù)后的指標(biāo)。所以，對(duì)其共調(diào)節(jié)因子的研究有助于更好地闡明ER的作用機(jī)制，對(duì)于有效開(kāi)發(fā)治療乳腺癌的藥物具有重大意義。 GA9是以ERβ為誘餌利用酵母雙雜交技術(shù)從人乳腺cDNA文庫(kù)中分離到的未曾報(bào)道的與ER相互作用的蛋白質(zhì)(我們先將其命名為GA9)。我們已經(jīng)通過(guò)GST沉降和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)獲得了與酵母雙雜交結(jié)果相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明了GA9與ER之間存在特異性的蛋白質(zhì)間相互作用。為了進(jìn)一步探究GA

3、9的生物學(xué)功能，我們采用多種分子生物學(xué)方法。在轉(zhuǎn)染含雌激素受體應(yīng)答元件的ERE熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，在體外和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中GA9都能夠抑制ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，而GA9的點(diǎn)突變體則喪失了抑制ER介導(dǎo)的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的功能。為了深入研究GA9基因的功能，我們利用包涵體純化蛋白的方法純化了大量的GA9蛋白，通過(guò)免疫Balb/c小鼠制備了抗GA9的多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)自制的免疫血清具有比較

4、特異的信號(hào)，而且抗體效價(jià)也較高。利用此抗體我們?cè)诓煌娜橄侔┘?xì)胞系中檢測(cè)了GA9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GA9在這些細(xì)胞系中存在著表達(dá)差異。我們還構(gòu)建了GA9 siRNA真核表達(dá)載體，通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNA干擾敲低GA9后，ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)。同樣，利用自制的抗體通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)我們得到了與上述活性試驗(yàn)一致的結(jié)果。通過(guò)結(jié)晶紫生長(zhǎng)曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)GA9可以抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而通過(guò)RNA干

5、擾敲低GA9后，乳腺癌細(xì)胞增殖能力恢復(fù)。根據(jù)GA9基因同源分析，我們判斷GA9可能是ER的DNA或mRNA的甲基化酶。通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)，利用特異性甲基化酶抑制劑AZA(5-aza-2’deoxycytidine)處理后的GA9，喪失了對(duì)ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性的抑制，且呈現(xiàn)出梯度效應(yīng)。 這些研究結(jié)果表明，GA9可能是雌激素信號(hào)通路的一個(gè)新型調(diào)控因子。進(jìn)一步的深入研究將有助于了解雌激素信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制及其臨床治