PRMT2對(duì)AngⅡ 誘導(dǎo)VSMC增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2（PRMT2）是蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，通過甲基化蛋白質(zhì)氨基酸序列中的精氨酸殘基參與調(diào)控機(jī)體多種細(xì)胞過程。最近有研究發(fā)現(xiàn)PRMT2可能在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，PRMT2基因敲除小鼠與正常小鼠相比，在給予病理因素干擾后出現(xiàn)明顯的血管壁增厚、血管內(nèi)膜增生、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖現(xiàn)象。VSMC異常增殖是多種心血管疾病共同的病理特征，常伴隨心血管疾病發(fā)病進(jìn)程出現(xiàn)。引起VSMC異常增殖的誘因眾多，血

2、管緊張素Ⅱ（AngⅡ）則是誘導(dǎo)VSMC異常增殖的主要生物活性因子之一，AngⅡ可通過誘導(dǎo)血管內(nèi)炎癥反應(yīng)發(fā)生引起血管結(jié)構(gòu)炎性改變，促進(jìn)VSMC轉(zhuǎn)型、增殖。大量文獻(xiàn)報(bào)道，PRMT2在各種炎癥模型中表達(dá)均有顯著變化，PRMT2抑制炎癥反應(yīng)引起的細(xì)胞凋亡，影響炎癥反應(yīng)經(jīng)典信號(hào)通路NF-κB激活。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制蛋白（IκB-α）可能是PRMT2作用底物之一，我們推測(cè)PRMT2可能通過作用于IκB-α影響NF-κB信號(hào)通路及VSMC增殖?；?/p>

3、于此，本課題將深入探討PRMT2在AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖中的作用及其作用機(jī)制。
　　第一部分、AngⅡ?qū)SMC細(xì)胞內(nèi)PRMT2表達(dá)的影響
　　目的：觀察AngⅡ?qū)SMC細(xì)胞內(nèi)PRMT2表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)方法：用不同濃度（0、0.01、1、100nM）AngⅡ處理人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞不同時(shí)間（0、6、12、24h），MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率、Western blot檢測(cè)PRMT2、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白表

4、達(dá)量的變化，RT-PCR檢測(cè)PRMT2 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：血管平滑肌細(xì)胞增殖率、PCNA蛋白表達(dá)量隨AngⅡ處理濃度增加而增加，PRMT2 mRNA、蛋白表達(dá)水平隨AngⅡ處理濃度增加而降低（P<0.05）；血管平滑肌細(xì)胞增殖率、PCNA蛋白表達(dá)量隨AngⅡ處理時(shí)間增加而增加，PRMT2 mRNA、蛋白表達(dá)水平隨AngⅡ處理濃度、時(shí)間增加而降低（P<0.05）。
　　小結(jié)：AngⅡ濃度、時(shí)間依賴性下調(diào)VSMC中

5、PRMT2的mRNA、蛋白表達(dá)。
　　第二部分、PRMT2對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的影響
　　目的：明確PRMT2在AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖過程中的作用
　　實(shí)驗(yàn)方法：構(gòu)建PRMT2過表達(dá)載體，設(shè)立空載體（vector）組、AngⅡ處理組、AngⅡ+PRMT2組；利用siRNA技術(shù)沉默PRMT2基因，設(shè)立陰性對(duì)照（NC）組、AngⅡ處理組、siPRMT2組、AngⅡ+siPRMT2組，MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增

6、殖率和周期變化，Western blot法檢測(cè)PRMT2、PCNA表達(dá)量。
　　結(jié)果：與AngⅡ組相比，AngⅡ+PRMT2組G0/G1期比例增加（P<0.05），細(xì)胞增殖率降低、S期比例下降、PCNA表達(dá)量減少（P<0.05），過表達(dá)PRMT2可減弱AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的作用；siPRMT2組細(xì)胞增殖率、PCNA表達(dá)量及周期分布與NC組比較均無明顯變化，表明僅僅沉默PRMT2基因?qū)SMC增殖狀態(tài)無顯著影響；AngⅡ+siP

7、RMT2組與AngⅡ組相比，PRMT2表達(dá)量下降（P<0.05），細(xì)胞增殖率增加（P<0.05），PCNA表達(dá)量、周期分布也有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明沉默PRMT2基因在一定程度上進(jìn)一步增強(qiáng)AngII誘導(dǎo)VSMC增強(qiáng)的作用。
　　小結(jié)：PRMT2抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖。
　　第三部分、PRMT2影響VSMC增殖的機(jī)制
　　目的：探討PRMT2影響VSMC增殖的機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)方法：免疫熒光法檢測(cè)vect

8、or組、AngⅡ處理組、AngⅡ+PRMT2組NF-κB亞基p65細(xì)胞核內(nèi)外分布，Western blot檢測(cè)各組炎癥因子IL-1β、IL-6表達(dá)量以及IκB-α總蛋白量、磷酸化水平，免疫共沉淀法驗(yàn)證PRMT2和IκB-α的相互作用，ELISA法檢測(cè)各組培養(yǎng)基中甲基化產(chǎn)物ADMA含量。
　　結(jié)果：與vector組比較，AngⅡ處理組細(xì)胞核內(nèi)p65熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，IL-1β、IL-6表達(dá)量增加（P<0.05），而與AngⅡ組比

9、較，AngⅡ+PRMT2組核內(nèi)p65熒光強(qiáng)度顯著減弱，IL-1β、IL-6表達(dá)量減少（P<0.05），表明PRMT2可有效阻礙p65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，抑制NF-κB激活及炎癥因子表達(dá)；免疫共沉淀結(jié)果顯示PRMT2與IκB-α之間存在相互結(jié)合，PRMT2可能是通過作用于IκB-α影響了NF-κB從細(xì)胞質(zhì)向核內(nèi)轉(zhuǎn)移；與vector組比較，AngⅡ組IκB-α總蛋白量減少、磷酸化水平上調(diào)，ADMA含量減少（P<0.05），AngⅡ+PRMT2組與A

10、ngⅡ組相比，IκB-α總蛋白量增加、磷酸化水平下降，ADMA含量增加（P<0.05），PRMT2可能是通過甲基化IκB-α阻礙IκB-α磷酸化及降解，抑制NF-κB激活及炎癥反應(yīng)發(fā)生，影響VSMC增殖。
　　小結(jié)：PRMT2可能通過甲基化IκB-α阻斷NF-κB信號(hào)通路、抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖
　　結(jié)論：
　　1. PRMT2可能在AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖中起負(fù)調(diào)控作用。
　　2. PRMT2可能通過甲基