人前梯度蛋白2對TNF-α誘導的腸上皮屏障損傷的調(diào)控作用及其機制研究.pdf

1、目的：腸上皮屏障功能的損傷在IBD的發(fā)生、發(fā)展及疾病轉歸中均發(fā)揮重要作用。腸上皮屏障的完整性受一個復雜的網(wǎng)絡調(diào)控，其中緊密連接復合體的失調(diào)及腸上皮細胞功能的破壞是導致腸上皮屏障功能缺陷的重要原因。緊密連接復合體位于上皮細胞周圍頂端，由跨膜蛋白Occludin，Claudins，JAM以及胞漿蛋白ZO-1，ZO-2，ZO-3等組成，是上皮機械屏障最重要的組成部分，決定細胞間通透性的主要因素，緊密連接復合體若被破壞，細胞間通透性就會增加，細

2、菌、內(nèi)毒素及毒性大分子物質則可進入體循環(huán)，引發(fā)強烈的炎癥反應，而上皮細胞F-actin的重組和/或再分布也可以引起腸上皮屏障通透性改變。此外，腸上皮細胞增殖及重建是維持腸屏障完整性的另一重要因素，在損傷后，為了重新恢復上皮屏障完整性及胃腸功能，腸上皮細胞需要增生及遷移到損傷部位，從而參與屏障的損傷修復。TNF-α是一個多功能促炎因子，已被證實在IBD發(fā)病中起關鍵作用，能夠破壞腸道緊密連接功能，誘導細胞骨架重排，引起細胞膜通透性增高及炎癥

3、因子IL8，IL17，IFN-γ等釋放增加，同時影響腸上皮細胞增殖和凋亡途徑，最終破壞腸上皮屏障的完整性，導致潰瘍及膿腫形成。人前梯度蛋白2(Anteriorgradient protein2 homologue，AGR2)作為蛋白二硫化物異構酶家族成員之一，已被證實在維持IBD腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。AGR2基因突變?nèi)巳侯净伎肆_恩病及潰瘍性結腸炎的風險顯著增加，在IBD動物模型中，AGR2能夠維持小鼠腸道潘氏細胞及杯狀細胞穩(wěn)態(tài)，AG

4、R2基因敲除小鼠內(nèi)質網(wǎng)應激增加，易發(fā)展為嚴重的結腸回腸炎。以上研究表明AGR2對于IBD腸上皮細胞功能的維持發(fā)揮重要保護作用，但能否調(diào)控腸上皮屏障功能尚不清楚。本研究首次探討AGR2在TNF-α介導的腸上皮屏障損傷中的作用及其機制。
　　方法：通過體外培養(yǎng)人結腸腺癌細胞株Caco2細胞21天左右建立腸上皮屏障模型，加入rhTNF-α刺激損傷細胞，通過RT-PCR檢測AGR2mRNA表達，Western blot檢測AGR2蛋白表達

5、，初步確定AGR2基因在TNF-α誘導的腸上皮屏障損傷中的表達。進一步構建AGR2質粒，在建好的腸上皮屏障模型中預先轉染AGR2質粒和對照質粒，24小時后實驗組加入rhTNF-α刺激細胞，48小時后，應用跨膜電阻和熒光黃透過率檢測細胞膜通透性，Western blot檢測緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，Claudin-1及MLCK-P-MLC通路蛋白，NF-κBp65, YAP, p-YAP(S127), LATS1/2, P-

6、LATS1/2, P-MST1/2, cyclinD1, cyclinE1蛋白表達情況，免疫熒光染色觀察緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，細胞骨架F-actin及NF-κB P65分布情況，CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡，Transwell和劃痕實驗檢測細胞遷移能力，最后應用YAP蛋白特異性抑制劑維替泊芬來驗證AGR2改善TNF-α誘導的腸屏障損傷的機制，同樣在建好屏障的Caco-2細胞中預先轉染AGR2和對

7、照質粒，24小時后先加入維替泊芬，2小時后加入TNF-α，48小時后檢測細胞緊密連接蛋白表達及定位，細胞增殖、凋亡、遷移能力。
　　結果：⑴TNF-α誘導的腸上皮屏障損傷模型中，AGR2 mRNA及蛋白水平表達均下降。⑵在TNF-α誘導的腸屏障損傷模型中，細胞膜通透性明顯升高，表現(xiàn)為跨膜電阻下降和熒光黃透過率上升，緊密連接結構破壞，表現(xiàn)為ZO-1，Occludin，Claudin-1蛋白表達下調(diào)，免疫熒光結果顯示在正常對照組，緊密

8、連接蛋白位于細胞連接處，表現(xiàn)為連續(xù)的沿細胞邊界環(huán)繞的帶狀結構，連接緊密，無明顯間隙，應用rhTNF-α刺激細胞48小時后，緊密連接蛋白邊緣粗糙呈鋸齒狀分布，在細胞的交界處可見不連貫的缺口或裂隙樣表現(xiàn)，細胞骨架發(fā)生重排，而預先轉染AGR2質?？擅黠@抑制TNF-α引起的腸屏障損傷，表現(xiàn)為抑制腸上皮細胞通透性增加，可明顯減輕TNF-α誘導的緊密連接蛋白表達下降及結構破壞，抑制細胞骨架重排。⑶在TNF-α誘導的腸上皮屏障損傷中，NF-κBP65

9、-MLCK-P-MLC通路活化，而AGR2可抑制其活化，表現(xiàn)為MLCK蛋白表達減少及MLC磷酸化水平下降，NF-κB P65蛋白表達減少，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)NF-κB P65核內(nèi)移減少。⑷通過CCK-8檢測細胞增殖，結果顯示TNF-α可明顯抑制腸上皮細胞增殖，而AGR2可抑制TNF-α引起的腸上皮細胞增殖活性下降，進一步通過流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示與正常對照組相比，TNF-α刺激細胞組G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例減少

10、，而AGR2過表達組抑制TNF-α引起的G0/G1期細胞阻滯，使細胞周期順利從G0/G1期向S期和G2/M期過渡。而在凋亡檢測結果中，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激組細胞凋亡明顯增加，而AGR2過表達組可抑制TNF-α引起的細胞凋亡增加。⑸在細胞遷移能力檢測中，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，TNF-α組細胞遷移能力明顯減弱，而預先轉染AGR2質?？梢种芓NF-α引起的細胞遷移能力下降。⑹進一步探討AGR2改善TNF-α誘導的腸屏障損傷的機制，我們發(fā)現(xiàn)加

11、入TNF-α刺激后，YAP蛋白表達明顯下降，而其磷酸化水平明顯增加，而預先轉染AGR2質粒后，可抑制其s127磷酸化水平，促進YAP表達，免疫熒光結果顯示在正常對照組中，YAP蛋白定位于細胞核中，加入TNF-α刺激后，YAP蛋白由胞核移位到胞漿，而AGR2抑制YAP蛋白轉位至胞漿，從而保持其轉錄活性。⑺Western blot結果顯示AGR2可抑制Hippo通路上游蛋白P-LATS1/2(ser909)，P-MST1/2蛋白表達，AGR

12、2通過抑制MST1/2磷酸化，進而影響P-LATS1/2(ser909)蛋白表達，從而活化YAP蛋白。⑻加入YAP抑制劑維替泊芬后，YAP蛋白表達明顯下降，p-YAP(s127)表達明顯增加，證實維替泊芬可有效抑制YAP蛋白表達，進一步檢測緊密連接及細胞功能發(fā)現(xiàn)，加入維替泊芬后，AGR2的腸屏障保護作用被明顯削弱了，無論是在緊密連接調(diào)控和腸上皮細胞增殖、重建方面都明顯減弱，證實了AGR2通過調(diào)控YAP活性減輕TNF-α誘導的腸上皮屏障損

13、傷。
　　結論：①在體外實驗中證實AGR2基因可以抑制TNF-α誘導的腸上皮細胞通透性增加，改善緊密連接功能，穩(wěn)定細胞骨架，并且這種保護作用可能通過抑制NF-κB和MLCK-P-MLC通路活化實現(xiàn)的。②YAP活化參與AGR2改善TNF-α的腸上皮屏障損傷過程，AGR2通過抑制Hippo通路上游MST1/2磷酸化進而活化YAP蛋白，AGR2通過調(diào)控YAP蛋白活性促進緊密連接功能、腸上皮細胞增殖和重建從而改善TNF-α誘導的腸上皮屏障