HIF-1α在IFN-γ及TNF-α協(xié)同引起腸上皮屏障功能損害中的作用.pdf

1、一、背景與目的
　　 腸上皮屏障功能損害是嚴(yán)重?zé)齻缙诓±砩碜兓闹匾獧C(jī)制之一。嚴(yán)重?zé)齻笫軕?yīng)激、缺血缺氧、炎癥反應(yīng)等的影響，全身腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）等炎癥細(xì)胞因子釋放急劇增加，同時(shí)腸道局部組織也產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子與燒傷后發(fā)生的腸道屏障功能損害有什么關(guān)系，它們是否參與燒傷后腸道屏障功能損害的發(fā)生，如果參與，其分子機(jī)制又是什么，目前的研究資料尚不能完全回答這些

2、問題。
　　 過去的研究表明，IFN-γ、TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子可以單獨(dú)或協(xié)同引起腸上皮屏障功能損害，細(xì)胞因子可通過誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chainkinase, MLCK）蛋白表達(dá)，引起肌球蛋白輕鏈（myosin light chain, MLC）磷酸化水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞緊密連接（tight junction, TJ）相關(guān)蛋白ZO-1、occludin、claudin-1改變，從而

3、損害腸上皮屏障功能。但是，細(xì)胞因子誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞MLCK蛋白表達(dá)增加的分子機(jī)制還不完全清楚。
　　 缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是調(diào)節(jié)機(jī)體對缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成。HIF-1α亞基由氧濃度調(diào)節(jié)表達(dá)，HIF-1β亞基則持續(xù)表達(dá)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)的調(diào)控中也具有重要作用。氧濃度并非是調(diào)節(jié)HIF-1

4、α的唯一因素，在常氧條件下炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等對HIF-1α的蛋白積聚、DNA 結(jié)合活性及其靶基因的表達(dá)均有重要調(diào)節(jié)作用。因此，我們假設(shè)：作為一種既參與缺氧適應(yīng)性調(diào)控反應(yīng)又在炎癥反應(yīng)調(diào)控中起重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α有可能通過調(diào)控腸上皮細(xì)胞MLCK蛋白表達(dá)，從而參與IFN-γ及TNF-α協(xié)同引起的腸上皮屏障功能損害。本課題利用體外單層腸上皮細(xì)胞模型，研究HIF-1α是否通過誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞MLCK蛋白表達(dá)而參與了I

5、FN-γ及TNF-α協(xié)同引起的腸上皮細(xì)胞屏障功能損害，以進(jìn)一步闡明嚴(yán)重?zé)齻竽c上皮屏障功能損害的分子機(jī)制。
　　 二、方法
　　 1．以體外培養(yǎng)的人腸上皮細(xì)胞株Caco-2 單層為研究對象，用IFN-γ（10ng/mL）或/與TNF-α（10ng/mL）處理腸上皮細(xì)胞單層。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖（FITC-dextran）熒光示蹤法檢測腸上皮細(xì)胞單層的通透性，電阻測定儀檢測跨腸上皮細(xì)胞單層電阻（TER），免疫熒光法

6、檢測TJ蛋白ZO-1及occludin分布形態(tài)的變化，用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HIF-1α、ZO-1、occludin、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC 磷酸化的變化。
　　 2．研究分別應(yīng)用HIF-1α抑制劑寡霉素（40μg/mL）及YC-1（400μmol/L）抑制HIF-1α
　　 蛋白表達(dá)對IFN-γ與TNF-α處理引起的腸上皮細(xì)胞單層通透性、TER、TJ蛋白分布形態(tài)、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC

7、磷酸化的影響。
　　 3．研究采用RNA 干擾技術(shù)沉默HIF-1α基因?qū)FN-γ與TNF-α處理引起的腸上皮細(xì)胞單層通透性、TER、HIF-1α、TJ蛋白、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC 磷酸化的影響。
　　 三、主要結(jié)果
　　 1．IFN-γ或TNF-α單獨(dú)作用對腸上皮細(xì)胞單層TER、TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形態(tài)、HIF-1α蛋白表達(dá)、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC 磷酸化無明顯影響；而IFN-γ

8、r>　　 及TNF-α協(xié)同作用則引起腸上皮細(xì)胞單層通透性明顯增加，TER 顯著降低，TJ蛋白ZO-1及occludin的分布形態(tài)不規(guī)則，而且occludin在細(xì)胞漿內(nèi)分布明顯增加，即發(fā)生重新分布，HIF-1α蛋白表達(dá)、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC 磷酸化明顯增加；但是，IFN-γ或TNF-α
　　 無論單獨(dú)還是協(xié)同作用，對腸上皮細(xì)胞單層TJ蛋白o(hù)ccludin的蛋白表達(dá)含量均無明顯影響。
　　 2．HIF-1α抑制劑寡霉

9、素能減輕IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮屏障功能損害，表現(xiàn)在寡霉素能改善IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮細(xì)胞單層通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形態(tài)改變。同時(shí)，寡霉素能明顯抑制IFN-γ
　　 及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮細(xì)胞單層HIF-1α蛋白表達(dá)、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC磷酸化水平增加。
　　 3．HIF-1α抑制劑YC-1也能減輕IFN-γ及TNF-α協(xié)同作

10、用引起的腸上皮屏障功能損害，表現(xiàn)在YC-1能改善IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮細(xì)胞單層通透性增加、TER降低以及TJ蛋白ZO-1、occludin分布形態(tài)改變。同時(shí)，YC-1能明顯抑制IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮細(xì)胞單層HIF-1α蛋白表達(dá)、MLCK蛋白表達(dá)以及MLC磷酸化水平增加。
　　 4．采用RNA 干擾明顯抑制腸上皮細(xì)胞HIF-1α表達(dá)后，IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮屏障功能損害包

11、括腸上皮細(xì)胞單層通透性增加及TER降低均得到明顯減輕，同時(shí)IFN-γ及TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮細(xì)胞單層MLCK蛋白表達(dá)及MLC 磷酸化水平增加基本恢復(fù)至正常。
　　 四、結(jié)論
　　 1．IFN-γ與TNF-α協(xié)同作用引起腸上皮屏障功能損害、TJ蛋白ZO-1及occludin形態(tài)發(fā)生改變尤其是occludin 重分布、MLCK蛋白表達(dá)增加以及MLC 磷酸化水平增加，同時(shí)伴有HIF-1α蛋白表達(dá)增加。HIF-1α可能是

12、IFN-γ與TNF-α協(xié)同引起腸上皮屏障功能損害的重要介質(zhì)。
　　 2．HIF-1α抑制劑寡霉素及YC-1均能減輕IFN-γ與TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮屏障功能損害、TJ蛋白ZO-1及occludin 形態(tài)發(fā)生改變、MLCK蛋白表達(dá)增加以及MLC磷酸化水平增加。HIF-1α參與了IFN-γ與TNF-α協(xié)同作用引起的腸上皮屏障功能損害的發(fā)生。
　　 3．沉默HIF-1α基因能減輕IFN-γ與TNF-α協(xié)同作用引起的腸上