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文檔簡介
1、乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒,它可以導(dǎo)致慢性乙型肝炎,嚴(yán)重危害人類健康。干擾素(IFN)類和核苷酸類被廣泛運(yùn)用于臨床。然而,慢性乙型肝炎的治療是一個(gè)長期過程,在用IFN-α治療時(shí),隨著時(shí)間的延長和用藥次數(shù)的增加,HBV對(duì)IFN-α的敏感性會(huì)下降,使得IFN-α抗HBV作用減弱。大量臨床研究也發(fā)現(xiàn),乙型肝炎患者在長期運(yùn)用IFN-α治療時(shí),很容易導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn),這為乙型肝炎的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。
IFN-α主要通過J
2、AK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用,而信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)在這個(gè)通路中發(fā)揮重要作用。研究表明,STAT1的表達(dá)及其修飾影響IFN-α抗HBV活性。因此,研究STAT1的變化及其相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況,對(duì)于研究IFN-α治療HBV有著重要意義。HepG2.2.15細(xì)胞是抗HBV新藥開發(fā)的一個(gè)良好的體外研究工具,它能夠在體外進(jìn)行無性繁殖,并能長期穩(wěn)定分泌HBsAg,、HBeAg和Dane顆粒,是體外篩選抗HBV藥物的良
3、好模型。本課題組通過小劑量 IFNα-2b(50 IU/ml)長期(6個(gè)月)不斷刺激 HepG2.2.15細(xì)胞,建立耐IFNα-2b的HepG2.2.15細(xì)胞模型。耐藥細(xì)胞株對(duì)IFNα-2b敏感性降低,對(duì)HBsAg、HBeAg、HBV DNA的抑制作用明顯減弱。本課題組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探究HepG2.2.15細(xì)胞、HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1與耐藥的關(guān)系及可能的作用機(jī)制。
目的:通過小劑
4、量IFNα-2b(50 IU/ml)長期(6個(gè)月)不斷刺激HepG2.2.15細(xì)胞,建立耐 IFNα-2b的 HepG2.2.15細(xì)胞模型——HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞,探究HepG2.2.15細(xì)胞,HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)通路中STAT1與耐藥的關(guān)系及可能的作用機(jī)制。
方法:
1.實(shí)驗(yàn)采用Western blot法分別檢測(cè)不同濃度(0,250,500,1000 IU
5、/ml) IFNα-2b作用72 h,對(duì)照組細(xì)胞、3個(gè)月刺激組細(xì)胞以及6個(gè)月刺激組細(xì)胞p-STAT1、STAT1蛋白表達(dá)情況,并探討p-STAT1/STAT1的差異。
2.以HepG2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞上清液,采用ELISA法檢測(cè)其HBsAg、HBeAg的量,PCR-熒光探針法檢測(cè)HBV DNA量。探討HepG
6、2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表達(dá)量變化。
3.以HepG2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下分別給予0, IFNα-2b(1000 IU/ml)作用24 h,分別和不給藥組比較,采用ELISA法檢測(cè)其HBsAg、HBeAg的量;采用PCR-熒光探針法檢測(cè)HBV DNA的量;采用Western-blot檢測(cè)
7、STAT1、p-STAT1、OAS1蛋白表達(dá)情況,采用qRT-PCR檢測(cè)法檢測(cè)STAT1、OAS1、USP18的mRNA表達(dá)情況。探討IFNα-2b對(duì)HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞抗HBV活性變化。
4.以HepG2.2.15細(xì)胞為對(duì)照組細(xì)胞,HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞為模型組細(xì)胞,對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞相同數(shù)目下分別給予0, IFNα-2b(1000 IU/ml), IFNα-2b(1000 IU/m
8、l)+JAK抑制劑(1μM), IFNα-2b(1000 IU/ml)+TSA(30 nmol/ml), IFNα-2b(1000 IU/ml)+ JAK抑制劑(1μM)+ TSA(30 nmol/ml)24 h,采用ELISA法檢測(cè)其HBsAg、HBeAg的量;采用PCR-熒光探針法檢測(cè)HBV DNA的量,采用Western-blot檢測(cè)p-STAT1、STAT1、OAS1蛋白表達(dá)情況,采用qRT-PCR檢測(cè)法檢測(cè)STAT1、OAS1
9、、USP18的mRNA表達(dá)。通過JAK抑制劑、HDACi影響JAK-STAT通路中STAT1的磷酸化和乙?;?,觀察IFNα-2b抗HBV活性變化。探討JAK抑制劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)對(duì)HepG2.2.15/IFNα-2b細(xì)胞IFNα-2b抗HBV活性的影響。
結(jié)果:
1.小劑量IFNα-2b(50 IU/ml)刺激6個(gè)月的細(xì)胞在給予不同濃度的IFNα-2b后,和對(duì)照組細(xì)胞比較,STAT1蛋白表達(dá)
10、上調(diào),p-STAT1蛋白表達(dá)下調(diào),且p-STAT1/STAT1下降明顯。
2.模型組細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg量較對(duì)照組輕微增加,HBV DNA量降低,但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.在給予IFNα-2b作用后,IFNα-2b對(duì)模型組細(xì)胞的HBsAg、HBeAg、HBV DNA抑制作用降低。與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞STAT1蛋白表達(dá)增多,但磷酸化的STAT1表達(dá)下調(diào),同時(shí),磷酸化的STAT1占STAT1比例降低。ST
11、AT1、USP18的mRNA水平上調(diào),OAS1 mRNA水平下調(diào)。
4. JAK抑制劑、HDACi對(duì)對(duì)照組細(xì)胞和模型組細(xì)胞IFNα-2b抗HBV活性有著不同程度上的影響。JAK抑制劑、HDACi對(duì)對(duì)照組的影響程度大于模型組細(xì)胞。
結(jié)論:
1.長期小劑量IFNα-2b刺激HepG2.2.15細(xì)胞后,細(xì)胞對(duì)IFNα-2b敏感性降低,表現(xiàn)為IFNα-2b對(duì)HBsAg、HBeAg、HBV DNA抑制作用的減弱。
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