克隆的BKCa通道在AngⅡ誘導HEK293細胞增殖中的調(diào)控作用.pdf

1、BKCa通道是鉀離子通道的一種，其標志性特征是能被細胞內(nèi)升高的Ca2+濃度和去極化協(xié)同激活。表達在不同組織細胞的BKCa通道參與許多生理功能的調(diào)控。BKCa通道以四聚體的形式存在，由形成孔道的功能性a亞基和不同的調(diào)節(jié)性β亞基組成，這就形成了BKCa通道的分子多樣性。BKCa通道的組織細胞及功能特異性與其不同β亞基構成有關，比如，β1亞基在血管平滑肌細胞(VSMCs)分布豐富。BKCa通道對于VSMCs膜電位的維持與血管肌源性調(diào)節(jié)起著非常

2、重要的作用。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)BKCa通道亦參與細胞增殖調(diào)控，尤其是在腫瘤細胞，但是關于BKCa通道在AngⅡ誘發(fā)VSMCs細胞增殖中的作用及其機制尚不清楚。
　　由于VSMCs膜上存在眾多的離子通道，它們之間相互影響，交互作用復雜，因而很難孤立地研究某一通道的功能特性。研究表明，HEK293細胞膜上存在的內(nèi)源性通道很少，因而作為一種有效的真核表達系統(tǒng)被廣泛地應用于外源性離子通道的研究中。本課題研究目的是建立人BKCaa+b

3、1亞基/BKCaa亞基在HEK293細胞的表達系統(tǒng)，并探討B(tài)KCa通道在AngⅡ誘導HEK293細胞增殖過程中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.1將克隆有人BKCa通道a亞基cDNA和b1亞基cDNA的重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa轉化擴增、提純后行酶切鑒定。
　　1.2.用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒和表達綠色熒光蛋白（GFP）的報告基因質(zhì)粒pEGFP共轉染HEK293細胞。用熒光顯微鏡檢測報告基

4、因GFP的表達。
　　1.3.用免疫細胞化學染色方法觀察BKCab1亞基在HEK293-hSloa+b1細胞膜表面的表達定位；用蛋白印記實驗檢測BKCaa及BKCab1亞基蛋白在HEK293-hSloa+b1細胞的表達。
　　1.4.用膜片鉗技術記錄轉染細胞BKCa通道的單通道電流，分析其動力學、藥理學特性。
　　2.1.通過MTT法測定AngⅡ誘導轉染的HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細胞生長

5、的量效曲線及時效曲線。
　　2.2.用免疫細胞化學技術觀察AngⅡ，IbTX，AngⅡ+IbTX，AngⅡ+TEA及NS1619對HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細胞增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響。
　　2.3.用流式細胞術（FCM）檢測AngⅡ，IbTX，AngⅡ+IbTX，AngⅡ+TEA及NS1619對HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細胞周期的影響。
　　結果

6、：
　　1.1.重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa擴增后，目的基因片段沒有丟失并且成功插入載體的相應位點；與pEGFP共轉染HEK293細胞后，報告基因GFP高效表達。免疫細胞化學染色證實轉染后的HEK293細胞形態(tài)良好，在HEK293-hSloa+b1細胞膜表面有BKCab1亞基的表達，蛋白印記實驗表明在HEK293-hSloa+b1細胞BKCaa及BKCab1亞基蛋白表達陽性。
　　1.2.通過

7、膜片鉗技術在HEK293-hSloa+b1細胞記錄到外源性BKCa通道電流。通道的開放呈現(xiàn)電壓依賴性及Ca2+敏感性；電流-電壓關系呈線性，單通道電導為151±7pS；BKCa通道特異性激動劑NS1619對通道具有激活作用，而BKCa通道特異性阻斷劑IbTX對通道具有阻斷作用。
　　2.1.AngⅡ可濃度依賴性、時間依賴性地誘導轉染的HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細胞增殖。AngⅡ（100nmol/L）可

8、顯著增加轉染細胞PCNA的陽性表達率，BKCa通道阻斷劑IbTX及TEA可顯著降低AngⅡ誘導的轉染細胞PCNA陽性表達。
　　2.2.FCM檢測結果表明AngⅡ可誘導HEK293-hSloa+b1/HEK293-hSloa細胞S期細胞百分數(shù)增加，IbTX可抑制AngⅡ誘導的G1期細胞向S期的轉換，并且明顯降低了G2細胞的百分數(shù)，從而阻滯細胞的有絲分裂。
　　結論：
　　本研究將克隆有人BKCa通道a+b1亞基/a亞基

9、cDNA的重組質(zhì)粒pIRES-hSloa+b1/pIRES-hSloa轉染到HEK293細胞，通過免疫細胞化學、蛋白印記、膜片鉗等方法證實了人BKCaa+b1/a亞基在HEK293細胞的功能性表達，獲得高效表達人BKCaa+b1/a亞基的真核表達系統(tǒng)；通過免疫細胞化學、FCM、藥理學實驗等方法首次探討并證實了BKCa通道介導調(diào)控了AngⅡ誘導的HEK293細胞增殖。為進一步闡明BKCa通道介導調(diào)控AngⅡ誘導HEK293細胞增殖過程中的