調(diào)節(jié)Ref-1的表達(dá)對(duì)HEK293細(xì)胞抗氧化應(yīng)激功能的影響.pdf

1、氧化應(yīng)激(oxidativestress)是指由于氧自由基過(guò)量生成和/或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，導(dǎo)致氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過(guò)量聚集，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。氧化還原因子-1(Redoxeffectfactor-1)又稱作脫嘌呤/脫嘧啶內(nèi)切核酸酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease)，是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一種多功能蛋白。它在細(xì)胞堿基修復(fù)途徑中作用于脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)

2、，主要參與由于氧化性損傷造成的DNA損害的修復(fù)；同時(shí)，Ref-1也是一種氧化還原作用因子，影響多種核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，通過(guò)對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原修飾來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的表達(dá)。此外，Ref-1在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤生理及細(xì)胞氧化應(yīng)激中都發(fā)揮重要的作用。 近年來(lái)，有關(guān)Ref-1在抗氧化性損傷作用機(jī)制的研究逐步深入。多種應(yīng)激誘導(dǎo)Ref-1表達(dá)增加可抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其機(jī)制尚不明確。本課題通過(guò)改變Ref-1蛋白在HEK2

3、93細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其對(duì)細(xì)胞抗氧化性損傷的功能影響，并探討可能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究Ref-1抗氧化性損傷的機(jī)制提供新的思路和理論基礎(chǔ)。 主要研究方法和結(jié)果： 1.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1介導(dǎo)的Ref-1高表達(dá)載體。利用RT-PCR方法從Hela細(xì)胞中克隆人的全長(zhǎng)Ref-1cDNA片段，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)，Ref-1與質(zhì)粒載體上EGFP片段之間以內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(inter

4、nalribosomeentrysite，IRES)相連，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的Ref-1高表達(dá)載體。測(cè)序及酶切結(jié)果表明，從Hela細(xì)胞中成功擴(kuò)增人的全長(zhǎng)Ref-1cDNA片段，載體構(gòu)建正確。 2.構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Pmscv/hyg介導(dǎo)的Ref-1RNA干擾載體。PCR擴(kuò)增人U6啟動(dòng)子序列和EGFP序列，分別插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Pmscv/hyg。在Ref-1的mRNA鏈上分別選定4個(gè)不同位點(diǎn)作為干擾的目標(biāo)序列，化學(xué)合成寡核苷

5、酸，在U6啟動(dòng)子的下游插入干擾序列獲得shRNA-Ref-1表達(dá)體。測(cè)序及酶切結(jié)果表明重組載體構(gòu)建成功。 3.病毒感染HEK293細(xì)胞。重組質(zhì)粒PLEGFP-N1-Ref-1和Pmscv-Ref-1-siRNA及相關(guān)對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT-67，24小時(shí)后收集上清感染靶細(xì)胞?？股谿418和Hygromycin分別篩選陽(yáng)性細(xì)胞14天。RT-PCR及westernblot檢測(cè)Ref-1mRNA及蛋白表達(dá)。 4.調(diào)

6、節(jié)Ref-1表達(dá)對(duì)細(xì)胞抗氧化損傷的影響。200μM、400μM、600μMH2O2分別刺激Ref-1高表達(dá)及對(duì)照組細(xì)胞30min，12小時(shí)后MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞間死亡率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。亞致死量(200μM)H2O2刺激Ref-1低表達(dá)及對(duì)照組細(xì)胞30min，12小時(shí)后收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀術(shù)、MTT實(shí)驗(yàn)及Hoechest33258染色法證實(shí)沉默Ref-1增加細(xì)胞對(duì)氧化刺激的敏感性：細(xì)胞死亡率升高，活力下降(P<

7、0.05)。同時(shí)，下調(diào)Ref-1減弱細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力。 5.Westernblot檢測(cè)Bcl-2、Bax、caspase-3和cytochromec。下調(diào)Ref-1的表達(dá)增加細(xì)胞對(duì)H2O2誘導(dǎo)凋亡的敏感性，Westernblot檢測(cè)在此過(guò)程中Bcl-2上調(diào)受到抑制，而B(niǎo)ax升高，caspase-3被激活，cytochromec從線粒體中釋放。 結(jié)論及研究意義:1.構(gòu)建了高效抑制蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2.高表達(dá)Ref

8、-1不能提高細(xì)胞對(duì)氧化性損傷的抵抗3.抑制Ref-1的表達(dá)增加細(xì)胞對(duì)氧化性損傷的敏感性，Bcl-2上調(diào)受到抑制，Bax表達(dá)升高，caspase-3被激活，cytochromec釋放。 本研究證實(shí)抑制Ref-1的表達(dá)引起細(xì)胞對(duì)氧化性損傷敏感性增加，同時(shí)Bcl-2上調(diào)受到抑制，Bax表達(dá)升高，caspase-3被激活，cytochromec釋放，是一種典型線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。由此，我們推測(cè)Ref-1在氧化應(yīng)激中與Bcl-2家族蛋白