膠霉毒素對(duì)HEK-293細(xì)胞氧化應(yīng)激性DNA損傷作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的:膠霉毒素(GT)廣泛存在于里氏木霉、青霉、煙曲霉和白色念珠菌等致病菌或環(huán)境微生物的次生代謝產(chǎn)物中，研究證明GT的產(chǎn)生主要來(lái)源于煙曲霉毒素，另外通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC)的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膠霉毒素存在于動(dòng)物（如豬，奶牛，家禽）的飼料中，也產(chǎn)生于玉米的貯存過(guò)程。體外實(shí)驗(yàn)表明膠霉毒素有很強(qiáng)的抗菌、抗病毒作用，呈現(xiàn)出較好的藥用前景，曾一時(shí)被認(rèn)為可用于抗腫瘤治療。但隨后的研究表明膠霉毒素具有抑制血管生成、免疫抑制，抑制NF-kB及其他特定

2、基因表達(dá)及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等毒性。本研究通過(guò)觀察膠霉毒素誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞的遺傳毒性，以及其引起ROS的產(chǎn)生和溶酶體膜通透的改變，旨在探討GT對(duì)DNA損傷的可能毒性機(jī)制，為進(jìn)一步評(píng)估膠霉毒素對(duì)人類(lèi)的健康影響提供試驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法:以HEK-293細(xì)胞作為試驗(yàn)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(SCGE)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot)檢測(cè)GT對(duì)體外HEK-293細(xì)胞DNA損傷情況以及DNA損傷蛋白的高表達(dá)(A

3、TM和P53)水平，進(jìn)而驗(yàn)證膠霉毒素的DNA損傷毒性。為了進(jìn)一步探討其可能的DNA損傷機(jī)制，以2'，7'—二氫二氯熒光素(DCFH)和吖啶橙(AO)分別測(cè)定膠霉毒素對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)以及溶酶體膜穩(wěn)定性的影響，通過(guò)N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)試驗(yàn)觀察氧化性損傷在DNA損傷中的作用，以及對(duì)溶酶體膜穩(wěn)定性的影響。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS v12.7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:當(dāng)膠霉毒素(GT)作用于HEK-293細(xì)胞1小時(shí)后

4、，彗星試驗(yàn)顯示其引起DNA雙鏈斷裂，熒光顯微鏡下與DMSO空白對(duì)照組相比，細(xì)胞成彗星樣拖尾，其趨勢(shì)隨著濃度而遞增，其中尾長(zhǎng)增長(zhǎng)，尾DNA％以及DNA％含量明顯增大;同時(shí)，GT（0.3125μM～1.25μM）可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平升高，溶酶體膜穩(wěn)定性下降。用NAC干預(yù)劑預(yù)處理后，GT所引起的HEK293細(xì)胞的拖尾現(xiàn)象、細(xì)胞內(nèi)ROS以及溶酶體膜通透都有明顯地減弱。作用24小時(shí)后，膠霉毒素同樣能誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞的DNA損傷，其損傷

5、蛋白的表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)效應(yīng)趨勢(shì)，而此時(shí)未出現(xiàn)HEK293細(xì)胞的凋亡發(fā)生，DNA損傷蛋白ATM/P53的表達(dá)水平可被抗氧化劑NAC有效干預(yù)，結(jié)果出現(xiàn)DNA損傷高表達(dá)蛋白明顯的下降趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:膠霉毒素在高濃度0.625μM-1.25μM的作用下能夠引起HEK293細(xì)胞的DNA損傷，說(shuō)明其具有遺傳毒性。同時(shí)，GT可導(dǎo)致HEK-293細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，并使溶酶體膜穩(wěn)定性下降。而抗氧化劑NAC在降低了