bFGF干預(yù)對體外壓瘡深部組織肌細(xì)胞氧化應(yīng)激作用及其機(jī)制探討.pdf

1、壓瘡深部組織損傷（Deep Tissue Injury，DTI）好發(fā)于受壓骨隆突處，為壓瘡中最為嚴(yán)重分期，亦為臨床護(hù)理重點和難點。此類壓瘡具有皮膚深部組織肌層損傷的特點，局部持續(xù)受壓時，血流灌注受阻、產(chǎn)生大量自由基造成肌細(xì)胞損傷。其發(fā)生潛匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，極易發(fā)展為難愈性創(chuàng)面。目前壓瘡機(jī)制研究集中于動物實驗，尚未有針對DTI機(jī)制的體外細(xì)胞干預(yù)性研究。堿性成纖維生長因子(bFGF)是一種多能細(xì)胞生長因子，對多種細(xì)胞損傷效果確切，因此，建立

2、體外DTI模型，在細(xì)胞水平探討bFGF調(diào)控骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制及其相關(guān)蛋白表達(dá)，或許能夠深入理解深部組織損傷，為其防治提供新視野。
　　第一部分:體外壓瘡深部組織肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建體外壓瘡深部組織細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，為進(jìn)一步在細(xì)胞層面探討壓瘡深部組織損傷機(jī)制建立基礎(chǔ)。
　　方法:選取對數(shù)生長期大鼠成肌細(xì)胞，分為對照組及5個實驗組。對照組行常規(guī)培養(yǎng)，5個實驗組分別采用50、100、150、200、25

3、0μmol/L過氧化氫處理1-4 h后檢測四氮甲基唑藍(lán)(MTT)，根據(jù)MTT結(jié)果重點觀察不同氧化應(yīng)激水平作用4小時后乳酸脫氧酶(LDH)變化、肌細(xì)胞Hoechst染色及形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果:1.對照組1至4h細(xì)胞存活為100％，細(xì)胞活性無明顯變化。
　　2.實驗組過氧化清濃度在100μmol/L以下具有促細(xì)胞增殖作用，高于100μmol/L在2h后均呈損傷趨勢，至4h大鼠成肌細(xì)胞存活率為20％-75％不等。
　　3.

4、大鼠成肌細(xì)胞形態(tài)隨氧化應(yīng)激程度加重而縮收，細(xì)胞間隙漸增。
　　4.Hoechst細(xì)胞熒光染色顯示100μmo/L過氧化氫作用4h已有較多肌細(xì)胞趨向凋亡。
　　5.成肌細(xì)胞在100μmo/L過氧化氫作用4小時后LDH釋放率相比對照組具有顯著性差異。
　　結(jié)論:1.大鼠成肌細(xì)胞隨氧化應(yīng)激程度加重，肌細(xì)胞活力下降伴隨細(xì)胞膜通透性增加及胞核漸進(jìn)性凋亡的發(fā)展過程。
　　2.經(jīng)100μmo/L過氧化氫作用4h的成肌細(xì)胞可作為

5、研究壓瘡深部組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的體外模型。
　　第二部分:bFGF干預(yù)在體外壓瘡深部組織肌細(xì)胞損傷中的作用
　　目的:在已構(gòu)建體外DTI氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，探討bFGF在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用
　　方法:常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長為指數(shù)增長期后，統(tǒng)一換液。根據(jù)有無H2O2及bFGF干預(yù)可分為四組:正常對照組(Con)，單純bFGF組(bFGF)，氧化應(yīng)激組(H2O2)及干預(yù)組(bFGF+H2O2)。氧化應(yīng)

6、激組過氧化氫及時間點的確定參照R.Dhanya等研究方法及我們前期體外DTI細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[43，51])，干預(yù)組(bFGF+H2O2，bFGF濃度綜合參考Wang等[52,53]研究)。正常對照組不做任何處理。單純bFGF組:提前給予100 ng/ml bFGF2 h。氧化應(yīng)激組:采用100μmol/L雙氧水培養(yǎng)基處理4h。干預(yù)組:100 ng/ml bFGF預(yù)給2h后，加入100μnmol/L雙氧水繼續(xù)孵育4h。各組于實驗

7、終點分別進(jìn)行多水平檢測。免疫熒光分析肌細(xì)胞活性氧自由基水平，Bax及細(xì)胞色素C表達(dá)情況;SABC免疫組織化學(xué)法于倒置顯微鏡下觀察Bcl-2與Bax表達(dá)變化;蛋白印跡檢測肌細(xì)胞PARP,PCNA等蛋白表達(dá)趨勢。
　　結(jié)果:1.氧自由基表達(dá)情況:活性氧自由基顯示氧化應(yīng)激組中大鼠成肌細(xì)胞ROS熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽性，細(xì)胞突觸變短，胞質(zhì)回縮明顯。干預(yù)組相比應(yīng)激組氧化應(yīng)激強(qiáng)度顯著下降(p＜0.01）。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示:正常對照組及

8、單純bFGF組大鼠成肌細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量Bcl-2顆粒，僅少數(shù)細(xì)胞少量表達(dá)Bax顆粒;應(yīng)激組Bcl-2陽性顆粒銳減，而Bax表達(dá)顯著增加;若于造模前提前給予bFGF干預(yù)2小時，則可上調(diào)Bcl-2水平，抑制Bax表達(dá)。
　　3.間接免疫熒光方法檢測Bax、Cyt.C蛋白。結(jié)果顯示:正常對照組及單純bFGF組Bax及Cyt.C熒光較弱。氧化應(yīng)激組Bax熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽性，同時Cyt.C滲入胞外，呈紅色彌漫性熒光顆粒。而含有bFGF的干預(yù)

9、組Bax熒光強(qiáng)度明顯減弱，Cyt.C仍局限于胞質(zhì)，熒光顆粒亮度減弱。
　　4.Western blot檢測顯示正常對照組及單純bFGF組Bax蛋白，Cyt.C及PARP蛋白呈現(xiàn)低水平表達(dá)，PCNA水平較高;氧化應(yīng)激組Bax、Cyt.C及PARP蛋白表量明顯增加，細(xì)胞增殖分裂進(jìn)程受阻;干預(yù)組能夠顯著下調(diào)大鼠成肌細(xì)胞Bax蛋白、細(xì)胞Cyt.C及PARP水平，同時增加Bcl-2、PCNA表達(dá)量。
　　結(jié)論:1.外源性bFGF能夠通