異丙酚對氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、異丙酚(propofol),又名丙泊酚,化學(xué)名稱為2,6-雙異丙基酚(2,6-di-isopropyl phenol),是一種快效、短效靜脈麻醉藥。由于其具有舒醒迅速而完全,持續(xù)輸注后無蓄積等特點,因此目前普遍應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持,也常用于麻醉中、手術(shù)后與ICU病房的鎮(zhèn)靜。除了常規(guī)的催眠、鎮(zhèn)靜與遺忘作用外,目前認(rèn)為異丙酚還具有降低動脈血壓,降低氧化應(yīng)激損傷以及抑制炎癥反應(yīng)等的功能,具體表現(xiàn)為:抗氧化,減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,抑制細(xì)胞凋

2、亡,減輕白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞粘附、抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā),調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的平衡,改善缺血心肌細(xì)胞再灌注后高能磷酸鹽合成,改善低灌流狀態(tài)下肝細(xì)胞對氧的再攝取,抑制高血糖癥大鼠腦組織再灌注后乳酸堆積及組織水腫,直接改善細(xì)胞能量代謝障礙等。在這些效應(yīng)中,起關(guān)鍵作用的就是異丙酚的抗氧化效應(yīng)。
　　 氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(rea

3、ctivenitrogenspecies,RNS)產(chǎn)生過多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤,蛋白酶分泌增加,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。ROS包括超氧陰離子(.O2-)、羥自由基(.OH)和過氧化氫(H2O2)等；RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和過氧化亞硝酸鹽(.ONOO-)等。其中一氧化氮(NO)是L-精氨酸(L—Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide

4、synthase,NOS)催化下生成的一種氣體自由基。在應(yīng)激和炎癥等病理條件下,NO與O2-結(jié)合形成過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)。ONOO-是一種很強(qiáng)的嗜核RNOS,它可以使蛋白的酪氨酸殘基亞硝基化,這樣便可以通過抑制酪氨酸磷酸化來調(diào)節(jié)蛋白的功能,還可導(dǎo)致DNA損傷、脂質(zhì)過氧化、蛋白降解、蛋白半胱氨酸殘基發(fā)生S-亞硝酰化等,最終可致細(xì)胞損傷或死亡。NOS有三種亞型,即神經(jīng)型(neuronal NOS,nNOS)、內(nèi)皮型(endothel

5、ial NOS,eNOS)和誘生型(iducible NOS,iNOS)三種NOS。其中,nNOS和eNOS又稱為結(jié)構(gòu)性NOS(cNOS)。cNOS主要調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生少量NO,其生理功能是通過控制血管舒張來維持血壓和局部血液循環(huán)。iNOS又稱為誘生型NOS,即一般認(rèn)為在靜止的細(xì)胞中不存在或含量非常低,但可為多種不同刺激所誘導(dǎo),這些刺激包括LPS、TNF-α、IL-1β、IFN-γ以及缺氧等。氧化應(yīng)激時,主要表現(xiàn)為iNOS升高,誘導(dǎo)

6、細(xì)胞產(chǎn)生大量NO,形成過量的過氧化亞硝酸鹽進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷。最近研究表明,iNOS的表達(dá)受p38 MAPK的調(diào)控。
　　 p38 MAPK于1993年被Han等發(fā)現(xiàn),由360個氨基酸組成,分子量約38kD,屬應(yīng)激激活的蛋白激酶。目前已發(fā)現(xiàn)p38 MAPK家族成員有p38α、p38β、p38γ、p38δ。鑒于p38α,p38β都有各自的剪切亞型,因而共有6個p38 MAPK亞型；各個亞型之間的不同功能可能與其在不同組織的表達(dá),激

7、活方式以及底物特異性相關(guān),不同的p38能被細(xì)胞應(yīng)激(紫外線輻射、滲透性休克、熱休克、脂多糖、蛋白合成抑制劑)、細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,YNF-α)等激活。研究表明,激活P38 MAPK可以誘導(dǎo)iNOS表達(dá)增加。最近研究發(fā)現(xiàn),抑制P38 MAPK.可以抑制LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)。
　　 氧化應(yīng)激活性中間產(chǎn)物,如過氧化

8、氫、過氧化亞硝基陰離子、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和四羥基壬烯醛等,既是細(xì)胞信號調(diào)節(jié)分子,又是細(xì)胞毒性效應(yīng)子。它們能攻擊體內(nèi)的生物大分子,導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas deathdomain-associated protein,Daxx)密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到一定程度的氧化應(yīng)激刺激時,平時定位于細(xì)胞核中的Daxx蛋白,就會從細(xì)胞核移位到細(xì)胞漿,進(jìn)而激活定位于細(xì)胞漿

9、內(nèi)的凋亡信號調(diào)節(jié)激酶-1(apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1),并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ASK1是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3Ks)家族成員之一。多種應(yīng)激損傷和促炎因子(如H2O2、TNF-α、缺血再灌注和化療藥物等)都可以激活A(yù)SK1,活化的ASK1又依次激活MKK4/MKK7-JNK和M

10、KK3/MKK6-p38激酶途徑,對應(yīng)激做出應(yīng)答或促使細(xì)胞凋亡。
　　 首先我們以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象,研究第三丁基過氧化氫(t-BHP)刺激時,異丙酚抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的機(jī)制。我們分離培養(yǎng)并鑒定了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,通過Western blot檢測異丙酚對t-BHP刺激下p38MAPK磷酸化的影響,并用RT-PCR檢測iNOS和eNOS的表達(dá)。接著我們以人HEK293細(xì)胞作為研究對象,研究H2O2刺激時,異丙酚對HEK

11、293細(xì)胞的保護(hù)作用,然后采用免疫熒光、核質(zhì)分離以及Western blot等實驗技術(shù)研究在H2O2刺激下,異丙酚對Daxx-ASK1信號通路的影響。所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS13.0處理,所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,方差齊性用Levene檢驗。MTT的結(jié)果相同劑量不同處理的兩組之間采用studentt-test進(jìn)行分析。Western-blot灰度值、RT-PCR熒光值在One-Wa

12、y ANOVA多重比較中,方差齊性采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett’T3法檢驗。取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果表明,各組之間p38 MAPK磷酸化有顯著差異(F=154.311,p<0.001),與對照組相比,t-BHP處理后能顯著誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中p38 MAPK磷酸化(p<0.001),而與t-BHP組相比異丙酚預(yù)處理后可以抑制t-BHP誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化(p<0.001)。其次,各組之間iNO

13、S、eNOS有顯著差異(F=934.786,p<0.001；F=664.946,p<0.001),t-BHP組iNOS和eNOS表達(dá)增加(與對照組相比,iNOS:p=0.001,eNOS:p<0.001),而異丙酚預(yù)處理后可明顯抑制其表達(dá)(與t-BHP組相比,iNOS:p=0.001,eNOS:p<0.001),更重要的是p38 MAPK抑制劑SB203580也可以抑制iNOS和eNOS表達(dá)(與t-BHP組相比,iNOS:p=0.001

14、,eNOS:p<0.001)。這表明t-BHP通過誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化,增加iNOS和eNOS的表達(dá),從而產(chǎn)生氧化損傷。而異丙酚能抑制t-BHP誘導(dǎo)的p38MAPK磷酸化,抑制iNOS和eNOS的表達(dá),在臍靜脈內(nèi)皮氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用。這些結(jié)果提示:提示異丙酚通過抑制p38 MAPK的磷酸化,減少iNOS、eNOS表達(dá),減輕氧化應(yīng)激從而起到保護(hù)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用,從一個方面揭示了,氧化應(yīng)激時異丙酚的保護(hù)機(jī)制。我們采用MTT實驗

15、驗證了在200-500μmol/L濃度H2O2刺激下,異丙酚100μM預(yù)處理對HEK293細(xì)胞具有一定的抗氧化保護(hù)作用(與200-500μmol/L,H2O2刺激組相比,異丙酚預(yù)處理+200-500μmol/L H2O2刺激組t,p分別為t=-4.420,p=0.001；t=-7.538 p<0.001；t=9.173 p<0.001；t=0.403,p<0.001)。進(jìn)而我們采用保護(hù)效應(yīng)明顯的300μmol/L濃度的H2O2刺激下,通

16、過免疫熒光以及Western blot我們都證實,異丙酚能夠一定程度上抑制由氧化應(yīng)激刺激所誘導(dǎo)的Daxx蛋白出核(與H2O2刺激組相比,免疫熒光:p=0.042,Western blot:p=0.001),以及ASK1的激活(與H2O2刺激組相比,Western blot:p=0.001)。相比于正常對照組,H2O2刺激時異丙酚處理組仍然有一定程度的Daxx出核以及ASK1的激活。這也與MTT實驗結(jié)果相吻合,說明異丙酚只能部分緩解氧自由

17、基對細(xì)胞所造成的損傷。而在氧化應(yīng)激時,異丙酚之所以能夠抑制Daxx蛋白的出核,我們推測這可能與其具有明確的抗氧化作用有關(guān)。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上異丙酚與維生素E,丁化羥基甲苯等抗氧化劑十分相似,均具有一種酚羥基結(jié)構(gòu),可直接與氧自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的2-6-二異丙酚基苯氧集團(tuán)而清除氧自由基。Kokita等人發(fā)現(xiàn)臨床麻醉濃度異丙酚即可減輕過氧化氫引起的脂質(zhì)過氧化,微量血漿濃度異丙酚就可以保護(hù)細(xì)胞膜,而且在與血漿蛋白結(jié)合的狀態(tài)下仍能發(fā)揮其抗氧化作用。另外

18、,異丙酚具有良好的脂溶性,能積聚在細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子膜上,提高細(xì)胞抗氧化損傷的能力。由此可見異丙酚在對抗氧自由基損傷,保護(hù)細(xì)胞方面具有重要功能。最新研究發(fā)現(xiàn)異丙酚可抑制氧化應(yīng)激引起的caspase-3活性的增加,降低內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡；通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulatedkinases1/2,ERK1/2)信號通路抑制促凋亡蛋白Bad(Bcl-X1/Bcl-2 associated

19、deathpromoter)和Bax(Bcl-2-associated X Protein)的表達(dá),相對增加抗凋亡蛋白的濃度,進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡作用。鑒于以上結(jié)果我們由此推測,異丙酚正是通過這些綜合作用減弱了氧自由基對細(xì)胞的損傷,進(jìn)而使Daxx蛋白的出核減少,ASK1激活程度降低。
　　 綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)異丙酚通過抑制p38 MAPK的磷酸化,減少iNOS、eNOS表達(dá),抑制Daxx蛋白出核及ASK1的激活,減輕氧化應(yīng)激