免疫增效抗前列腺癌DNA疫苗抑瘤活性的初步研究.pdf

1、研究背景：前列腺癌是威脅人類健康的重要疾病，特別進展到雄激素非依賴期的前列腺癌目前仍然沒有特別有效的治療方法。免疫治療很可能成為治療前列腺癌的很有前景的一種方法。DNA疫苗作為免疫治療的一種方式，已經(jīng)在臨床前和臨床實驗中進行了廣泛的研究，DNA疫苗具有安全性好、特異性高以及易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等方面的優(yōu)勢正在成為前列腺癌免疫治療的重要發(fā)展方向。但是，DNA疫苗也存在轉(zhuǎn)染效率低下，誘導的免疫反應較弱的缺點，本研究我們通過對靶抗原的選擇，佐劑的應

2、用以及遞送方式的改進等方面來加強DNA疫苗誘導的免疫反應，為前列腺癌DNA疫苗的免疫增效進行探索性研究。
　　研究目的：本研究將前列腺干細胞抗原（PSCA）和免疫佐劑IL-12共同構(gòu)建到同一真核表達載體中成為新型的前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12，通過電穿孔的方法遞送疫苗到小鼠體內(nèi)，觀察DNA疫苗的抑瘤效果并對其可能的免疫學機制進行初步的探討。
　　方法：
　　1.將PCR方法擴增的mI

3、L-12基因其克隆到pVAX1-IRES載體中IRES序列的下游構(gòu)建免疫增效載體pVAX1-IRES-mIL-12，在此基礎上將RT-PCR方法從RM-1細胞系中擴增的mPSCA基因克隆到該質(zhì)粒IRES的上游，構(gòu)建前列腺癌DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12。質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細胞后分別通過WesternBlot驗證mPSCA的表達，ELISA法驗證mIL-12的真核表達；電穿孔法遞送質(zhì)粒到小鼠體內(nèi)驗，分別驗證mP

4、SCA和mIL-12基因的活體內(nèi)表達。本部分中還構(gòu)建了pVAX1-mPSCA質(zhì)粒作為新的DNA疫苗的對照，驗證了其體內(nèi)外的表達情況。
　　2.將mPSCA基因去除信號肽后構(gòu)建到原核表達載體pet-42a中，IPTG誘導并純化mPSCA蛋白，通過WesternBlot和ELISA檢測純化后的mPSCA蛋白的免疫原性。
　　3.將所構(gòu)建的DNA疫苗采用電穿孔肌肉內(nèi)注射的方式免疫小鼠，觀察所構(gòu)建的DNA疫苗的抑瘤效果，并對其相關的

5、免疫學機制進行初步的研究：采用ELISA檢測免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和血清中的細胞因子的水平；采用LDH法體外檢測免疫小鼠細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應；采用ELISPOT法檢測免疫小鼠脾淋巴細胞特異性IFN-γ的分泌；采用流式細胞術(shù)檢測免疫小鼠的離體腫瘤組織內(nèi)的腫瘤浸潤淋巴細胞；對全身其他器官進行病理組織切片染色（HE）觀察疫苗免疫后小鼠其他組織有無炎癥反應和組織損傷。
　　結(jié)果：
　　1.酶切及測序結(jié)果證實成功構(gòu)建

6、了pVAX1-IRES-mIL-12、pVAX1-mPSCA和pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12質(zhì)粒，并且證實了各個質(zhì)粒在體外和體內(nèi)均可以有效表達。
　　2.酶切和測序結(jié)果證實成功構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-42a-mPSCA，誘導并純化出大小約為40KD的融合蛋白；WesternBlot和ELISA檢測顯示純化后的mPSCA蛋白具有免疫原性。
　　3.觀察不同質(zhì)粒免疫后的小鼠移植瘤生長趨勢，發(fā)現(xiàn)與對照組相比DNA疫

7、苗組成瘤時間延長3d；疫苗組小鼠腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤抑制率達77.96％。DNA疫苗組小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體滴度大于12800；可以檢測到疫苗組小鼠血清細胞因子IL-12和IFN-γ的增加，淋巴細胞特異性的IFN-γ的分泌達2430.00±157.36SFU/106個脾淋巴細胞；疫苗組淋巴細胞與對照組相比對腫瘤細胞的殺傷效率明顯增加，在效靶比為40:1、20:1和10:1時，CTL的殺傷率分別為33.19±0.24%、26.67

8、±0.73%和20.44±0.26%。在疫苗組免疫的小鼠腫瘤組織中可以檢測到CD8+T細胞的浸潤。疫苗免疫后小鼠中低量表達PSCA抗原的正常組織病理切片中沒有發(fā)現(xiàn)自身免疫性炎癥反應和組織損傷的證據(jù)。
　　結(jié)論：本研究在靶抗原的選擇、佐劑的應用、DNA遞送方式等方面為DNA疫苗的免疫增效研究做出了新的嘗試。所構(gòu)建的新型免疫增效DNA疫苗pVAX1-mPSCA-IRES-mIL-12與其他對照組相比在小鼠體內(nèi)可以誘導產(chǎn)生更強的特異性細