桑樹miRn51與靶基因研究及桑樹瞬時(shí)表達(dá)體系的建立.pdf

1、微小RNA(miRNA，microRNA)是一類長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸、內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子RNA，通過與靶基因序列互補(bǔ)配對(duì)的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)。除了通過翻譯抑制、切割等方式負(fù)調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá)外，還可以通過miRNA激活等對(duì)靶基因進(jìn)行正調(diào)控。miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和病毒等有機(jī)體中，參與了生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)生物學(xué)過程。
　　桑樹（Morus L.）是一種落葉喬木，除了

2、用于栽桑養(yǎng)蠶外，還具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。隨著桑樹基因組高通量測(cè)序的完成和小RNA文庫的建立，為桑樹miRNA的研究提供了平臺(tái)。目前，對(duì)于桑樹抗逆性、獨(dú)特藥用價(jià)值、與家蠶間關(guān)系等方面的研究已有報(bào)道，但是關(guān)于miRNA與功能基因之間的調(diào)控關(guān)系方面的研究甚少。
　　基于川桑小RNA文庫，從中分析得到一個(gè)新miRNA(miRn51)。完成了其前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)、上游啟動(dòng)子序列以及靶基因預(yù)測(cè)等信息學(xué)分析。分別從川?；蚪M和cDNA中克隆

3、到該miRNA的前體和成熟體序列。在此基礎(chǔ)上利用qRT-PCR和miRNA5'-RACE方法驗(yàn)證了miRn51切割MnPPO2基因的精確位點(diǎn)。以生長(zhǎng)2個(gè)月的粵桑(69851)幼苗為材料，對(duì)其進(jìn)行非生物脅迫（高溫、干旱、高鹽）和信號(hào)分子處理（ABA、SA、H2O2和MeJA），通過qRT-PCR方法分析脅迫下miRn51和靶基因的表達(dá)情況。最后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，對(duì)桑樹miRn51與其靶基因的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。本研究的主

4、要研究結(jié)果如下所示:
　　1、川桑miRn51序列及靶基因生物信息學(xué)分析
　　基于川桑根、雄花和葉3個(gè)組織小RNA Illumina HiSeq-2000測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得85個(gè)桑樹保守miRNA分子和262個(gè)組織特異的miRNA分子。依據(jù)其表達(dá)量和靶基因注釋信息篩選出10個(gè)候選miRNA進(jìn)行初步分析，最后根據(jù)研究興趣選擇在桑樹中首次發(fā)現(xiàn)的miRn51為研究對(duì)象進(jìn)行深入分析。發(fā)現(xiàn)miRn51具有典型植物miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

5、。啟動(dòng)子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)除了具有轉(zhuǎn)錄起始功能的CAAT-box和TATA-box等結(jié)構(gòu)域外，還包含多個(gè)脅迫響應(yīng)元件，如:干旱應(yīng)答(MBS)、病原菌響應(yīng)(TC-repeat)和抗氧化響應(yīng)(ARE)等。運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRn51潛在靶基因有8個(gè)，均為多酚氧化酶基因家族，其中miRn51與7個(gè)靶基因調(diào)控方式為切割，1個(gè)為翻譯抑制。從川?；蚪M中克隆了miRn51的前體序列的87個(gè)核苷酸，利用莖環(huán)PCR方法得到全長(zhǎng)為71 bp的產(chǎn)物，說明pre

6、-miRn51能夠加工為成熟miRn51。
　　2、川桑miRn51靶基因驗(yàn)證及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析
　　利用qRT-PCR方法對(duì)桑樹miRn51和其中的7個(gè)潛在靶基因在川桑五個(gè)組織中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明這些miRNA與靶基因的組織表達(dá)模式差異很大，其中Morus012130在花中特異表達(dá)，Morus012131在果實(shí)中表達(dá)量最高，Morus012128則在皮中表達(dá)量最高。說明同一個(gè)家族基因不同基因在同一植物中不同組織間表

7、達(dá)量是不盡相同的，暗示這些基因在不同組織中所起的功能存在著差異。值得注意的是Morus012121、Morus012122和Morus012124在根和皮中表達(dá)非常低，但卻在雄花、葉和果實(shí)中有較高的表達(dá)，與miRn51在相同組織中表達(dá)模式呈相反趨勢(shì)，這與mRNA與靶基因間的調(diào)控方式是一致的。推測(cè)miRn51可能調(diào)控的靶基因?yàn)镸orus012121、Morus012122和Morus012124。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)Morus012124編碼的蛋

8、白為多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO2)。
　　經(jīng)miRNA5'-RACE分析，miRn51切割靶基因精確位點(diǎn)分別在miRNA5'端第10-11、7-8個(gè)堿基的位置，切割頻率為分別為18/20和2/20。以生長(zhǎng)2個(gè)月大的粵桑(69851)幼苗為材料，分別進(jìn)行高溫、干旱、低溫、ABA、SA、H2O2和MeJA處理，檢測(cè)miRn51與MnPPO2在受到脅迫處理時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果表明，miRn51和MnPPO2基因

9、在不同脅迫處理時(shí)表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。
　　3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立及miRn51與MnPPO2表達(dá)分析
　　構(gòu)建PLGNL-35 S-miRn51植物超量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸染桑樹葉片從而形成瞬時(shí)表達(dá)體系。通過GUS組織化學(xué)染色、多酚氧化酶活性檢測(cè)以及熒光定量PCR等方法，分析不同緩沖液成分、農(nóng)桿菌浸染菌液濃度、轉(zhuǎn)化后時(shí)間以及不同桑樹品種等試驗(yàn)條件對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響。結(jié)果表明，1號(hào)緩沖液、農(nóng)桿菌菌液濃度OD6