桑樹病程相關(guān)基因非表達(dá)子基因MuNPR1的生物學(xué)功能研究.pdf

1、植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種病原物的侵染，在長(zhǎng)期的生存進(jìn)化中，植物形成了各種各樣的機(jī)制防御病原菌入侵。植物不同水平的多個(gè)抗病途徑交叉、重疊組成植物的抗病防御機(jī)制使植物表現(xiàn)出多種抗病形式。其中誘導(dǎo)抗性和基礎(chǔ)抗性是最為典型的兩種抗病形式。一般認(rèn)為基礎(chǔ)抗性是指植物表現(xiàn)出的對(duì)病原菌的天然本底抗性，這種抗性是植物與生俱來的，即植物抵御病原物的侵染機(jī)制是利用植物本身的與眾不同的結(jié)構(gòu)以及一些特殊化學(xué)成分,如果植物喪失了基礎(chǔ)抗性就會(huì)對(duì)病原菌表現(xiàn)出超感

2、病性。植物的誘導(dǎo)抗性機(jī)制是由于環(huán)境因子（包括生物因子和非生物因子）激活了植物的防御體系而產(chǎn)生對(duì)病原物的系統(tǒng)抗病性。病程相關(guān)基因非表達(dá)子1基因(NPR1)基因是植物抗病基因表達(dá)和系統(tǒng)獲得性抗性中的一個(gè)關(guān)鍵基因。NPR1不僅在植物系統(tǒng)獲得抗性和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性中起核心調(diào)控作用，而且是植物基礎(chǔ)抗性以及由抗病基因決定的抗性的重要調(diào)控因子。本研究根據(jù)已有的桑樹轉(zhuǎn)錄組信息，克隆得到桑樹 NPR1基因并將其命名為MuNPR1，利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)該基

3、因及其編碼蛋白的理化特性進(jìn)行了分析；同時(shí)構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，研究了MuNPR1的生物學(xué)功能。研究結(jié)果為揭示桑樹MuNPR1的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，為桑樹抗逆分子育種提供了有效候選基因。
　　本文的主要研究結(jié)果如下：
　　（1）桑樹MuNPR1的克隆及生物信息學(xué)分析
　　根據(jù)獲得的桑樹轉(zhuǎn)錄組信息，利用PCR技術(shù)克隆得到了桑樹病程相關(guān)基因非表達(dá)子1基因MuNP

4、R1（GenBank登錄號(hào)：JX204735)，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1743 bp，編碼580個(gè)氨基酸，編碼蛋白理論分子質(zhì)量為64.5 kDa，等電點(diǎn)為5.66。對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白是由許多α-螺旋和延伸片段及少量的轉(zhuǎn)角由無規(guī)卷曲聯(lián)系在一起折疊形成，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α-螺旋，其次為β-折疊和延伸片段，而轉(zhuǎn)角僅占4.46％。NPR1蛋白含有豐富的是亮氨酸，含量最少的是色氨酸。并且通過NCBI數(shù)據(jù)庫及SWISS-MODEL網(wǎng)站

5、對(duì)其所翻譯的蛋白進(jìn)行同源分析，發(fā)現(xiàn)MuNPR1與擬南芥AtNPR1同源性較高，并且包含一個(gè)保守的錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域和一個(gè)BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，可能具有與擬南芥AtNPR1相似的生物功能。
　?。?）桑樹MuNPR1的組織表達(dá)特異性分析
　　通過熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)桑樹根、芽、皮、花和葉中的MuNPR1的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示MuNPR1的表達(dá)沒有明顯的組織特異性，在桑樹根、芽、樹皮、花和葉中均有表達(dá)，在桑樹花和樹皮中的

6、表達(dá)量沒有明顯差別，而在葉片中的表達(dá)量相對(duì)較低。
　　（3）桑樹MuNPR1基因的生物學(xué)功能分析
　　構(gòu)建桑樹MuNPR1基因的植物表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)化了擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MuNPR1基因能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中高效表達(dá)。MuNPR1在擬南芥中高效表達(dá)使植株表型發(fā)生明顯變化，使轉(zhuǎn)基因植株開花提前，生長(zhǎng)周期變短。MuNPR1的高效表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomona

7、s syringaepv. tomato DC3000，Pst DC3000）的抗性，胼胝質(zhì)染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MuNPR1擬南芥植株在遭受Pst DC3000侵染時(shí)短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)來抵御病原菌的侵入。NBT染色和DAB染色檢測(cè)結(jié)果顯示因此，在植物遭受病原菌侵染時(shí)，MuNPR1有助于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)O2-和H2O2的積累，從而提高植物的抗病性。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn) MuNPR1擬南芥中 PR的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在正常情況下 MuN

8、PR1在擬南芥中的表達(dá)，能增加PR5基因的表達(dá)，但對(duì)PR1基因的表達(dá)沒有明顯影響，但在病原誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)MuNPR1擬南芥中PR1和PR5基因的表達(dá)量都明顯高于與野生型。因此，在生物脅迫下MuNPR1可能對(duì)其他抗病基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。
　　通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行干旱和鹽分脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MuNPR1基因擬南芥的抗旱和耐鹽能力明顯低于野生型植株。通過NBT和DAB染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)MuNPR1基因植物在鹽分和干旱脅迫下植物體內(nèi)H2O2和